不同劑量食用白酒對大鼠心臟功能和血管緊張素II的影響＊

蔣 慧，劉愛東，王 暉，陳遠壽，潘貴書

(1．遵義醫學院 09級生理學碩士研究生;2．遵義醫學院生理學教研室，3．遵義醫學院 07級生理學碩士研究生，貴州 遵義 563099)

酒精性心肌病(Acoholic Crdiomypathy，ACM)是因乙醇及其主要代謝產物乙醛對心臟直接或間接的損害造成的心肌紊亂，是一種特殊類型的擴張型心肌病，其病理改變表現為心肌細胞及間質水腫和纖維化，線粒體變性等［1］。其中腎素－血管緊張素系統(Renin－Angiotensin System，RAS)在ACM的發生和發展中發揮著重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS的主要作用因子。AngⅡ通過與其特異的受體結合發揮多種生物學效應［2，3］。病理狀態激活的 RAS可以引起高血壓、心肌肥厚、心力衰竭、血管疾病等［3］。本研究旨在探討不同劑量下食用白酒給予SD大鼠灌胃一定時間后，觀察大鼠收縮壓、左心室內壓、血漿AngⅡ的濃度及心肌血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)的表達。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 市售遵義某酒廠生產的53°食用白酒，AngⅡ放射免疫試劑盒(北京生物技術研究所)，RT－PCR所需試劑(大連寶生物工程有限公司)。

1．2 主要儀器 BL－420S生物實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，Eppendorf M aster－cycler Gradient(Eppendorf，德國)，iCycler iQ real－ time PCR儀(BIO－RAD，美國)。

1．3 實驗動物及分組 24只清潔級雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠，體重(200±20)g，由第三軍醫大學野戰外科研究所動物室提供(許可證號:SCXK－(渝)2002008)。大鼠適應性喂養1周后，用簡單隨機抽樣方法隨機分為低劑量組、高劑量組和正常對照組。低劑量和高劑量分別給予4 mL·kg－1·d－1、8 mL·kg－1·d－1的 53°食用白酒灌胃，對照組給予等體積量生理鹽水(4 mL·kg－1·d－1)灌胃。每天灌胃兩次，每次灌胃量均為當天總灌胃量的一半，兩次灌胃間隔時間超過8 h，每3天稱一次體重，連續60 d。灌胃期間各組大鼠自由進水、飲食自由。

1．4 大鼠血壓、左室內壓力的測定 20%水合氯醛(4 mL·kg－1)腹腔注射麻醉動物后，行右頸總動脈插管，經壓力傳感器與BL－420S生物信號處理系統相連，描記一段頸動脈壓波形后，繼續行左心室插管，再描記一段左心室壓力曲線，以MFL Lab200心功能軟件計算平均頸動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、左心室內壓(left ventricle pressureLVP)。

1．5 血漿AngⅡ的含量測定 大鼠血壓、左室內壓力的測定后，沿腹部正中線打開腹腔，分離下腔靜脈，取2 ml血液注入抗凝管中(每管含20μl 0.30M EDTA，20μl 0.34M 8－羥基喹啉硫酸鹽，10μl 0．32M 二巰基丙醇)，再取2 ml于存有肝素的抗凝管中，分別蓋好試管上下顛倒混勻后立刻投入冰水浴中，靜置1～2 h后以2 500轉/分4℃離心7 min，分離血漿。－80℃低溫冰箱保存。采用放射免疫方法測定血漿AngⅡ含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

1．6 大鼠左心室質量/體質量指數 (left ventricular weight/body weight，LVW/BW)采血后，迅速開胸取出心臟，預冷的生理鹽水沖洗干凈，清潔濾紙吸干水分，電子天平稱取左心室(含室間隔)，計算LVW/BW。

1．7 心肌組織形態學和電鏡觀察 一部分心肌組織用10%中性甲醛溶液固定，常規組織切片制作。經脫水、透明、透蠟后進行石蠟包埋，5μm連續切片，蘇木精－伊紅染色，光學顯微鏡觀察。另一部分心肌組織用2.5%戊二醛溶液固定，再行脫水、包埋、切片并染色后進行透射電鏡觀察。

1．8 實時定量PCR檢測心肌AT1 mRNA的表達心肌總RNA提取和純化按照試劑盒說明進行。采用Eppendorf M aster－cycler Gradient PCR儀逆轉錄后，通過iCycler iQ real－time PCR儀進行擴增。引物設計為:AT1上游引物 5＇－GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA －3＇，下游引物 5＇－ CTCTTT-GATGTCACGACGATTTC－3，擴增片段 320bp。β－actin上游引物 5＇－GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA －3＇，下游引物 5＇－ GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG－3＇，擴增片段150bp。反應條件:95℃ ，8 min30 s循環 1 次;95℃ 5 s，60℃ 20 s 循環40次。以Ct值為統計參數依次計算下列數據:①平均Ct=(Ct1+Ct2)/2(重復管);②dCt=平均Ct－中間值;③基因的表達以2△(－dCt)表示;④以目的基因的表達/β－肌動蛋白基因的表達對AT1 mRNA進行相對定量。

1．9 統計學處理 利用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。數值變量資料經正態性和方差齊性檢驗后，滿足條件者行F檢驗，有差異者進一步做兩兩比較的q檢驗(SNK檢驗)，數據采用表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 實驗期間各組大鼠行為學比較 實驗期間，灌胃2周時低劑量組、高劑量組大鼠行為與對照組無明顯不同。2周后高劑量組大鼠灌胃時出現抗拒行為，灌胃后出現煩躁不安、行走不穩，癥狀持續時間隨實驗的進行而逐漸延長。低劑量組與對照組之間沒有明顯差異。

2．2 食用白酒對大鼠心功能的影響 由表1結果可見，灌胃2月后，高劑量組收縮壓(SBP)、左室內壓(LVP)與低劑量組、對照組比較均有下降，但無顯著性差異(P＞0.05)。低劑量組與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 食用白酒對各組SBP和LVP的影響

2．3 食用白酒對大鼠左心室質量/體質量(LVW/BW)的影響 由表2結果可見，灌胃2個月時，高劑量組的BW、LVW及LVW/BW均略高于低劑量組、對照組，但無顯著差異(P＞0.05)。低劑量組與對照組之間比較也無明顯差異(P＞0.05)。

表2 食用白酒對各組LVW/BW的影響

2．4 大鼠心肌組織HE染色結果和電鏡結果 光鏡下，低劑量組和對照組心肌纖維結構正常，高劑量組心肌細胞有部分區域空泡樣變性(見圖1)。電鏡下，高劑量組心肌細胞核水腫，部分出現雙核仁，有空泡樣變性，線粒體明顯腫脹，嵴斷裂，部分出現絮狀變，肌絲排列紊亂，出現大量脂滴，肌絲間可見吞噬溶酶體(見圖2)。

2．5 食用白酒對大鼠血漿AngⅡ的含量的影響灌胃2月后，低劑量組(n=8)AngⅡ含量(1310．82±133．31)pg/mL，高劑量組(n=8)AngⅡ含量(1155．90 ±286．37)pg/mL，對照組(n=8)AngⅡ含量(1234．89 ±131．38)pg/mL，各組間血漿 AngⅡ含量比較無顯著性差異(P＞0.05)。

2．6 食用白酒對心肌組織AT1受體mRNA表達的影響 灌胃2月后，高劑量組AT1 mRNA表達降低，與低劑量組和對照組組比較有顯著性差異(P＜0.01)。低劑量組與對照組之間無明顯差異(P＞0.05)(見表3)。

表3 食用白酒對各組大鼠心肌組織AT1 mRNA表達的影響

3 討論

近幾十年來，由于生物化學、免疫組織化學特別是分子生物學技術的廣泛應用，對于心血管系統內分泌的研究結果證明，尚有獨立于循環RAS之外的RAS系統，其來源、作用機制與前者皆有不同，故稱為組織RAS系統。組織RAS具有雙重調節的作用，它既受自身RAS本身的調節，又受循環中的RAS的調節。在RAS系統中AngⅡ是起關鍵作用的效應肽。在心臟內，AngII既可以由循環RAS產生，也可以由自身RAS產生。AngⅡ主要通過作用于其Ⅰ型受體促進血管平滑肌細胞增殖、血管內皮細胞增生、心肌細胞肥大和心肌間質纖維化重塑［4］。新近一些研究表明慢性酒精攝入激活 RAS，通過 AngⅡ發揮心臟重構作用［5］。

ACM主要引起以左室肥厚為主心臟擴大，它以心肌重量增加、左室甚至全心擴張、心室壁由早期的代償肥厚至后期的失代償變薄、左室舒張和收縮功能障礙、心力失常以及充血性心力衰竭等改變為特征［6］。本實驗結果顯示:灌酒2個月，低、高劑量組大鼠的收縮壓，左室內壓，左心室質量/體質量，及血漿AngⅡ與對照組比較均無顯著性差異。光學顯微鏡下，低劑量組大鼠心肌纖維結構無明顯變化，高劑量組大鼠心肌纖維排列紊亂;而電鏡下高劑量組大鼠的心肌細胞出現雙核，線粒體腫脹，出現絮狀變等變化。RT－PCR顯示高劑量組與低劑量組和對照組比較心肌中AT1受體mRNA表達明顯降低。

我們推測:灌酒2個月，大鼠ACM發生在早期，盡管心肌細胞發生了超微結構的病變，但心臟功能處于代償期，因此收縮壓，左室內壓，左心室質量/體質量無明顯改變。同時檢測血漿AngⅡ含量尚無變化，有研究表明，糖尿病大鼠在糖尿病(diabetes mellitus，DM)發生10～12周時有心肌細胞增生和心肌細胞間質膠原沉積，此時心肌局部AngII含量已明顯升高，血漿AngII也從發病3個月開始升高［7］，提示灌酒2個月，心臟功能處于代償期，尚未引起血漿AngII含量的變化，表明心臟局部RAS在ACM的發生發展中起著非常重要作用，也說明白酒對大鼠心肌的損傷，出現酒精性心肌病變是一個很長的過程;這與飲酒的劑量和時間的長短有關系。對于高劑量組大鼠的心肌AT1受體mRNA表達明顯降低，我們推測可能是乙醇及乙醇的代謝產物乙醛損傷心肌，使得心肌局部分泌AngⅡ，AngⅡ濃度升高，高濃度AngⅡ負反饋抑制AT1RmRNA的表達所致，也有可能與食用白酒的其他非酒精成分有關，這有待進一步研究。

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