一例彌漫性大B淋巴細胞瘤組織樣本T細胞TCRα/β CDR3譜序的初步分析＊

孫永蘋，湯賢英，朱紅倩，楊雪峰，姚新生

(1．遵義醫學院 珠海校區臨床教學部，廣東 珠海 519100;2．遵義醫學院 免疫學教研室，貴州 遵義 563099;3．貴州省人民醫院 血液內科，貴州 貴陽 550002;4．遵義醫學院附屬醫院 胃腸外科，貴州 遵義 563099)

彌漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，占全部 NHL的30% ～40% 。非霍奇金淋巴瘤(NHL)是目前發病率增長速度最快的惡性腫瘤，現已占我國常見惡性腫瘤發病率的第八位，盡管近年來新的治療策略在一定程度上提高了淋巴瘤的療效，但仍有部分淋巴瘤采用常規治療方案不能被治愈。近年來，已證實在白血病患者外周血 αβT 細胞 TCR CDR3 存在克隆性增殖［1－3］，研究克隆性增殖可以了解白血病的發病和免疫應答機制，進而為白血病的治療提供基礎。FQPCR溶解曲線分析技術，可較好的用于臨床樣本TCR CDR3譜系的初步分析［4，5］。為研究淋巴瘤的免疫應答機制，初步了解其TCR CDR3克隆性增殖特點，本實驗采集了1例彌漫性大B淋巴細胞瘤患者和4例淋巴結增生志愿者組織樣本，利用FQ－PCR技術初步分析樣本中TCR Vα和TCR Vβ各家族CDR3譜系的整體情況，為淋巴瘤免疫應答機制的進一步研究提供基礎。

1 材料與方法

1．1 標本與試劑 經細胞形態學，組織化學等診斷為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者1例，取其淋巴瘤組織標本(由貴州省人民醫院提供)，4例淋巴結炎患者淋巴結組織(2男，2女)標本作為對照(由遵義醫學院第一附屬醫院提供)。mRNA提取試劑盒(TIANGENG公司)，cDNA合成 kit(MBI，Fermentas公司)，Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)等;Jurkat細胞(購自中南大學湘雅醫學院中心實驗室)。

1．2 引物設計與合成 引物參照文獻［6，7］合成，合成人TRAV基因家族的34條上游引物，及1條共同的TRAC下游引物;合成人TRBV基因家族的26條上游引物，及1條共同的TRBC下游引物;作為對照的GAPDH上游及下游引物，上述所有引物均由inviogen上海英駿生物技術有限公司合成。

1．3 mRNA提取和cDNA合成 按照mRNA提取試劑盒進行操作，提取Jurkat細胞、4例淋巴結炎和1例淋巴瘤組織中的mRNA，按cDNA合成kit條件，用Oligo dT作引物擴增cDNA(每個樣本合成4個反應管，每管20μl)。

1．4 FQ－PCR擴增 TCRVα和 TCRVβ各家族CDR3區段的cDNA

1．4．1 FQ－PCR擴增TCRVα32個家族CDR3區段的cDNA FQ－PCR擴增反應體系 每個樣本做36個PCR反應管，1－34管為樣本反應管，35管為GAPDH對照管，36管為無引物對照管;第1－34管分別加入TRAV1至TRAV32(期中TRAV1和TRAV4各有兩個亞家族)上游引物1μl，1－34管每管加入TRAC下游引物1μl，第35管加GAPDH上、下游引物;1－36管分別加樣品cDNA 1μl，1－36管每管加入熒光定量Mix 10μl、純水7μl(第36管加9μl純水)，總體積20μl。選取Jurkat細胞株的GAPDH表達量的相對量標準作為標準曲線。

FQ－PCR擴增反應條件:①擴增:94℃ 3 min，1 cycles;94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 50 sec，45 cycles;72℃ 10 min，1 cycles;②溶解曲線分析:75℃ －95℃間以0．2℃/秒讀取一個熒光值，100 cycles;③FQ－PCR產物取8μl做1．5%瓊脂糖凝膠電泳，其余樣本－20℃保存備用。

1．4．2 FQ －PCR 擴增 TCRVβ24家族 CDR3區段cDNA FQ－PCR擴增反應體系 樣本共做28個反應管，1－26管為樣本反應管，27管為GAPDH對照管，28管為無引物對照管;第1－26管分別加入TRBV1至TRBV24(期中TRBV5和TRBV13各有兩個亞家族)上游引物各1μl，1－26管每管再加入TRBC下游引物1μl;第27管加GAPDH上、下游引物各1μl;1－28管每管再加入樣品cDNA 1 μl;1－28管每管加入熒光定量Mix 10μl、純水7 μl(第28管加9μl純水)，總體積20μl。選取Jur-kat細胞株的GAPDH表達量的相對量標準作為標準曲線。

FQ－PCR擴增反應條件:①擴增:94℃ 3 min，1 cycles;94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 50 sec，45 cycles;72℃ 10 min，1 cycles;②溶解曲線分析:75℃ －95℃以 0．2℃/秒讀取一個熒光值，100 cycles;③FQ－PCR產物取8μl做1．5%瓊脂糖凝膠電泳，其余樣本－20℃保存備用。

1．5 普通PCR擴增 從Vα、Vβ鏈FQ－PCR溶解曲線中選取單峰家族TRAV 10、TRAV 18、TRBV 6、TRBV 24進行普通PCR擴增。普通PCR反應體系:取 FQ－PCR產物1μl，加入相應的 TRAV/TRBV上游引物2μl(引物濃度均為10 mmol/L)和相應 TRAC/TRBC下游引物2μl，加入 Taq DNA Polymerase 0．25 μl，2 mM dNTP 5 μl，10 × Buffer with KCL，25 mM MgCl2 3 μl，DDW 30．75 μl;總反應體積50μl;普通 PCR反應條件:α鏈:①95℃ 2 min，1 cycles;② 95℃ 30 sec，60℃ 1min，72℃ 1 min，35 cycles;③72℃ 10 min，1cycles;β鏈:① 94℃ 3 min，1 cycles;②94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35 cycles;③ 72℃ 10 min，1cycles。擴增產物經普通瓊脂糖凝膠回收后送測序。

2 結果

2．1 1例彌漫性大B淋巴細胞瘤和4淋巴結增生組織標本34個TRAV家族和26個TRBV家族CDR3譜型FQ－PCR產物在1．5%瓊脂糖凝膠電泳上，各家族CDR3在預測位置處顯示條帶。(圖1為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRAV各家族的電泳結果;圖2為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRBV各家族的分析結果)。

2．2 4例淋巴結增生組織標本中32個TRAV家族和24個TRBV家族CDR3譜型的FQ－PCR產物各家族相對定量表達不一，各家族CDR3譜型的溶解曲線圖顯示為多個峰型圖(多克隆和寡克隆);彌漫性大B淋巴細胞瘤患者組織32個TRAV家族和26個TRBV家族CDR3譜型的FQ－PCR產物各家族相對定量表達不一，部分TRAV和TRBV家族表現為單峰，極少家族表達極低(圖3為淋巴結增生－1組織標本TRAV各家族的分析結果，其它未列出;圖4為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRAV各家族的分析結果;圖5為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRBV各家族的分析結果;淋巴結增生組織標本TRBV各家族的分析結果未列出;圖6為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRAV10測序結果;圖7為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRAV18測序結果;圖8為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRBV6測序結果;圖9為彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRBV24測序結果)。

2．3 1例彌漫性大B淋巴細胞瘤患者中TRAV和TRBV單峰家族CDR3區測序的基因及氨基酸的組成不同(見表1)。

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圖9 彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRBV24測序結果

3 討論

近年來，淋巴瘤的臨床治療已經取得了一定的療效，明顯延長了患者的生存時間，但微小殘留病變仍然是患者復發死亡的重要原因。尋找腫瘤特異性CTL用作過繼免疫治療將為淋巴瘤微小殘留病變的治療提供新的途徑，而對成熟的T(或B)細胞腫瘤，可望通過將細胞表面的TCR CDR3序列(或BCR CDR3)作為一種特異的靶標，用于淋巴瘤治療或研制獨特型疫苗。目前，通過體外擴增或各種轉基因技術研制的腫瘤相關特異性CTL已經應用到白血病的治療［8，9］。FQ －PCR技術作為一種客觀、直觀的先進技術，可以對多種疾病中T細胞的TCR CDR3譜系進行初步的篩選［10］。

本文研究分析了4例淋巴結增生組織和1例彌漫性大B淋巴細胞瘤患者TRAV和TRBV各家族的CDR3譜序，研究發現4例淋巴結增生的TCR CDR3亞家族溶解曲線圖均為寡峰和多峰圖;本實驗1例彌漫性大B淋巴細胞瘤患者淋巴結組織αβT細胞TCR CDR3譜系分析發現:TCR alpha鏈AV10、AV18;TCR beta 鏈 BV6、BV24 家族出現較明顯的單峰圖，提示該單峰家族T細胞可能為機體在腫瘤相關抗原持續刺激下所產生的一種應答T淋巴細胞的克隆;對呈單峰家族的CDR3進行了測序分析，其基因和氨基酸組成不一致，提示這種克隆增殖的T細胞可能針對腫瘤B細胞不同表位應答產生的克隆性增殖。本實驗的技術和初步數據為進一步研究淋巴溜的應答機制和個體化的抗腫瘤T細胞治療提供了基礎。

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