牛奶中煙酸本底含量的測定

劉志楠，李海礁，宋曉東，葉峰，喻東威，解鑫

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司質量安全管理中心分析中心，內蒙古 呼和浩特 011500）

牛奶是天然的全營養物質，其微量元素的含量比較全面。早在1867年人們就在實驗室中合成了煙酸，而其真正得到發展是始于20世紀30年代，1937年C.A.Elvehijiem等分離出煙酸，不久又在肝臟中獲得煙酞胺[1]，一時間作為醫藥產品得到了迅速發展，新的用途被不斷的開發出來，其應用領域筱蓋醫藥、食品、飼料添加劑及化工助劑等行業。煙酸即3—毗吮甲酸，又名尼可丁酸，是結構最簡單、理化性質最穩定的一種維生素，是人體和動物中不可缺少的營養成分，它參與組織的氧化還原過程，具有促進細胞新陳代謝和擴張血管的功能，能促進人體和動物的生長發育[2-3]。煙酸不僅參與細胞內呼吸過程而且在VB6、泛酸和生物素的存在下還參與脂肪蛋白質和DNA的合成[4-5]，因此煙酸對人體有著重要的生理功能[6]。

關于水溶性維生素的檢測，以往文獻報道的方法主要包括微生物、高效液相法、酶法和免疫法等[7-8]，依據國標的方法，我們采用高效液相色譜法和微生物法對牛奶中的煙酸進行檢測。但國內文獻對牛奶中煙酸本底含量的相關報道卻很少。針對這種現象，我們選取410份中國各地的牛奶樣本進行大量的實驗，意在得出牛奶中煙酸含量的大致范圍，以指導乳制品企業在合理范圍內強化煙酸的添加量。本研究參考了AOAC[9]的方法，并使用煙酸檢測試劑盒[10]使微生物檢測煙酸的方法有較大程度的優化，使檢測時間有較大幅度的縮短。

為了評價食品標簽上標注成分的準確性。美國食品和藥物管理局FDA規定維生素在食品中的實際添加量必須為標簽上標注量的100%或更多，而原生維生素產品中的維生素含量必須為標簽上標注量80%或更多。European Directive2002/46/EC也制定了一系列法規，用于檢測添加過維生素的食品中標注的維生素含量[11]。2010年我國針對乳制品食品安全體系存在的一些列問題作出了相應的規定，出臺了最新國家標準作為檢測乳品中各種營養素的國家強制性檢測標準，國標GB5413-2010[12]《食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定》對嬰幼兒配方食品與奶粉中維生素含量的檢測方法、檢測限度、適用范圍等都做了明確的規定。作為乳品企業而言，產品必須符合國家的標準才可以出廠，其次了解煙酸的大致范圍可以給企業帶來新的利潤增長點。

牛奶屬于動物源性食品，牛奶中煙酸的含量受飼料、季節、環境、種群和牛個體差異的影響較大，所以數據會在一定的范圍內浮動。

1 材料與方法

1.1 高效液相色譜法

1.1.1 材料

中國各地的牛奶樣本。

1.1.2 試劑及設備

淀粉酶：酶活力≥25 nkat/mg；鹽酸；氫氧化鈉；鹽酸（2.4 mol/L）：準確移取10 mL鹽酸于50 mL容量瓶中，用水定容；氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L）：稱取5.0 g氫氧化鈉于50 mL容量瓶中，用水定容；高氯酸（HClO4）：體積分數為60%；甲醇（CH4O）：色譜純；異丙醇（C3H8O）：色譜純；庚烷磺酸鈉（C7H15NaO3S）：優級純。

U3000高效液相色譜儀（帶紫外檢測器）：美國UltiMate；pH計（精度為0.01，型號為S40+電導率模塊）、天平（感量為 0.1 mg，型號為 XS204）：瑞士mettler；E100H超聲波振蕩器：Elmasonic；培養箱（30℃～80℃，型號為Frioce11222）：德國MMM。

1.1.3 方法

試樣經熱水提取、酸性沉淀蛋白質后，以C18色譜柱分離，用紫外檢測器定量。

1.1.4 前處理

稱取混合均勻固體試樣約5.0 g（精確到0.0001 g）加入約25 mL 45℃～50℃的水，或稱取混合均勻液體試樣約20.0 g（精確到0.0001 g）于150 mL錐形瓶中，振搖，靜置5 min～10 min，充分溶解，并冷卻至室溫。將上述錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩約10 min。

1.1.5 測定液的制備

待試樣溶液降至室溫后，用鹽酸調節試樣溶液的pH至1.7±0.1，放置約2 min后，再用氫氧化鈉溶液調節試樣溶液的pH至4.5±0.1。將試樣溶液轉至50 mL容量瓶中，用水反復沖洗錐形瓶，洗液合并于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后經濾紙過濾，濾液再經0.45 μm微孔濾膜加壓過濾，用試管收集，即為試樣待測液。

1.1.6 參考色譜條件

色譜柱：C18柱（粒徑 5 μm，150 mm×4.6 mm）或具有同等性能的色譜柱。

流動相：甲醇70mL，異丙醇20mL，庚烷磺酸鈉1g，用910mL水溶解并混勻后，用高氯酸調pH至2.1±0.1，經0.45 μm膜過濾。

流速：1.0 mL/min。檢測波長：261 nm。柱溫：25℃。進樣量：10 μL。

1.1.7 標準品配制

煙酸及煙酰胺標準儲備液（1.0 mg/mL）：稱取煙酸及煙酰胺標準品各0.1 g（精確到0.0001 g），分別置于100 mL容量瓶中，用水溶解定容。

煙酸及煙酰胺混合標準中間液（40μg/mL）：分別準確吸取煙酸及煙酰胺標準儲備液2 mL至50 mL定量瓶中，用水定容，臨用前配制。煙酸及煙酰胺混合標準系列測定液：分別準確吸取煙酸及煙酰胺混合標準中間液 0.0、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，至 50 mL 容量瓶中用水定容。該標準系列濃度分別為0.00、0.80、1.60、4.00、8.00μg/mL。臨用前配制。

1.1.8 試樣溶液的測定

將試樣待測液進行色譜測定。記錄各組分色譜峰面積或峰高，根據標準曲線計算出試樣待測液中煙酸及煙酰胺各組分的濃度。

1.2 微生物法

1.2.1 材料

中國各地的牛奶樣本。

1.2.2 試劑及設備

煙酸檢測試劑盒：德國ifp公司；Elx808酶標儀（630 nm）：美國Biotek；AIR TECH超凈臺：蘇州安泰公司；微量可調移液器（100μL～1000μL、20μL～200μL）：德國 Eppendorf；一次性無菌濾膜（0.2 μm～0.22 μm）；5 mL一次性無菌注射器；15 mL無菌離心管；1.5 mL～2.0 mL無菌離心管。

1.2.3 菌種

植物乳酸桿菌 Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）。

1.2.4 方法

某些菌體生長對某種特定維生素具有較強的依賴性。配制選擇性的培養基，即含有菌體生長除待測維生素以外的所有營養元素，待測維生素添加的多少直接影響菌體的生長情況。通過添加不同濃度的待檢測維生素作為標注曲線，就可以半定量判定樣品中的特定維生素的含量，最后通過細菌生長的濁度顯示出來，因此根據標準曲線法通過測定的濁度來得出樣品中的煙酸含量[13]。

1.2.5 前處理

取1 mL樣品至50 mL離心管中，準確加入雙蒸水39 mL，漩渦混勻。在超凈臺中用 0.2 μm～0.22 μm 無菌濾膜過濾至1.5 mL～2.0 mL無菌心管中。

1.2.6 培養基制備

加入10 mL無菌水至維生素培養基中，蓋好瓶蓋，搖勻。在90℃～100℃水浴中加熱5 min以上，其間振蕩至少2次，迅速冷卻至室溫（低于30℃）。使用0.2 μm～0.22 μm無菌濾膜過濾培養基至15 mL無菌離心管中。

1.2.7 標準品配制

煙酸標準品用無菌水配置成不同的濃度梯度（0、0.016、0.032、0.064、0.096、0.160 mg/100 g），在 630 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，標品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.8 檢測步驟

將菌體包被于微孔中，取出需要數量的微孔板條并在板上固定，未使用的微孔板條立即放回原來的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，儲存在2℃～8℃條件下；用移液器吸取150 μL待檢維生素培養基至微孔中；用移液器吸取150 μL標準品或樣品至指定的微孔中；用粘合箔蓋住微孔條或微孔；在（37±1）℃黑暗條件下孵育44 h～48 h。

1.2.9 測量及計算

將微孔板漩渦混勻，用酶標儀630 nm條件下讀取濁度。使用維生素專用軟件進行計算（4P法）。

2 結果

2.1 煙酸標準曲線和色譜圖

微生物法煙酸標準曲線，見圖1；高效液相色譜法，見圖2。

圖1微生物法標準曲線相關系數均為1.000，效果較好。圖2高效液相色譜法標準品峰值和峰形較好。

2.2 不同方法檢測煙酸數據對比情況

選取10組樣本進行對比試驗，微生物法和高效液相色譜法檢測牛奶中煙酸的STD、RSD和CV值的統計結果見表1。

表1結果顯示：微生物法和高效液相色譜法檢測牛奶中煙酸數值的CV值都在10%的范圍內，相當于國標要求的檢測2個平行樣品之間的數值要求范圍，可見2種方法的結果是一致的，因此我們可以采用一種方法（微生物法）進行大量樣本的檢測。

圖1 微生物法煙酸標準曲線Fig.1 Microbiological assay of nicotinic acid standard curve

圖2 高效液相色譜法Fig.2 HPLC method

表1 不同方法檢測煙酸的統計數值Table 1 Different methods for the detection of niacin statistics

2.3 煙酸回收率的測定

選取的20組樣本作回收率抽樣統計，結果見表2。

由表2可見，微生物法回收率在79.5%～112.5%之間，檢測的結果符合回收率的要求。

2.4 煙酸相對標準偏差的測定

選取的20組樣本，同一樣品做平行樣檢測，相對標準偏差抽樣統計結果見表3。

表2 煙酸回收率的測定結果Table 2 Nicotinic acid recovery measurement results

表3 煙酸相對標準偏差的測定結果Table 3 Nicotinic acid and relative standard deviations of deter mination results

由表3可見：微生物法檢測相對標準偏差在2.4%～9.9%之間，檢測的結果較好。

2.5 煙酸大量數據的測定

煙酸大量數據的測定，見表4；煙酸的測定范圍和煙酸含量正態分布圖，見圖3和圖4。

表4 煙酸大量數據的測定結果Table 4 Results of determination of niacin to large amounts of data

圖3 煙酸的測定范圍Fig.3 Determination of niacin range

圖4 煙酸含量正態分布圖Fig.4 Nicotinic acid content of normal distribution

由表4、圖3和圖4可見：410組煙酸數據平均值為 87μg/100 mL，數據范圍在 36μg/100 mL～138μg/100mL。牛奶中煙酸含量大部分在70μg/100mL～120μg/100 mL之間。

3 結論與討論

實驗結果顯示：微生物法和高效液相色譜法的檢測結果一致。另對微生物法檢測煙酸的標準曲線相關系數、回收率和相對標準偏差進行統計，檢測結果都很好，另外高效液相色譜法因其檢測速度較慢、成本較高，所以我們采用微生物法進行大量樣本的測定。

微生物法對410組牛奶樣本進行統計分析結果顯示：煙酸平均值為87μg/100 mL，數據范圍在36μg/100 mL～138μg/100 mL之間。牛奶中煙酸含量大部分在 70μg/100 mL～120μg/100 mL 之間。

煙酸性質比較穩定，在沒有菌體污染的情況下損失較少。作為乳制品企業可以根據牛奶中煙酸的本底含量，適量添加煙酸即可以達到要求。

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