氟苯尼考殘留的酶聯免疫檢測方法的研究

馮才茂， 賈 瑜， 馬孝斌， 張德紅

(北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206)

氟苯尼考殘留的酶聯免疫檢測方法的研究

馮才茂， 賈 瑜， 馬孝斌， 張德紅

(北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206)

對氟苯尼考進行結構改造制備半抗原及抗原，免疫家兔得到多克隆抗體。經測定，該抗體對氟苯尼考和氟苯尼考胺均有反應，且靈敏度較高，效價達到1∶480 000;在此基礎上通過對各實驗條件參數的優化建立了間接競爭酶聯免疫檢測方法，該方法檢測限為0.5 μg/kg，以20，50 μg/kg進行空白樣品添加實驗，回收率為82.5% ～96.0%，批間變異系數在4.1% ～15.2%，可初步用于動物組織樣本中氟苯尼考殘留的檢測．

氟苯尼考;抗原制備;酶聯免疫檢測方法

氟苯尼考(florfenicol)，又名氟甲砜霉素，相對分子質量為358.213，是一種無臭的白色結晶，分子結構式見圖1，易溶于二甲基甲酰胺和甲醇，具有吸收好、體內分布廣、廣譜抗菌、安全高效等特點，對敏感菌所致的畜禽細菌性疾病治療效果顯著，作為氯霉素的替代藥物，廣泛應用于治療畜禽及水產的細菌性疾?。?］．氟苯尼考經動物體代謝后殘留物主要為氟苯尼考、氟苯尼考胺、氟苯尼考醇、氟苯尼考草氨酸等，在不同動物及不同臟器中代謝物的比例和成分有所不同，根據目前檢測標準，主要以氟苯尼考和氟苯尼考胺作為其殘留標識物［2］．

按推薦劑量使用時，氟苯尼考克服了氯霉素及甲砜霉素所致的再生障礙貧血的危險及其他毒性，不會對動物造成危害［3］．由于在實際生產中，往往存在用藥情況復雜，超劑量添加飼喂等，從而導致藥物殘留，甚至危害人體健康．各國對氟苯尼考的最大殘留量均有標準規定，如日本食品中殘留農業化學品肯定列表制度中規定，在豬和牛的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟等殘留限量為0.2 mg/kg;歐盟規定氟苯尼考在牛肌肉、肝、腎中殘留限量分別為 200，3 000，300 μg/kg，在雞的肌肉、脂肪、肝、腎中殘留限量分別為 100，200，2 000，300 μg/kg，在鰭魚類肌肉及皮殘留限量為1 000 μg/kg，在豬的肌肉、皮和脂肪、肝、腎中殘留限量分別為 100，500，2 000，500 μg/kg［4］;我國農業部235號公告也對其殘留限量做出了嚴格規定．

圖1 氟苯尼考分子結構式Fig．1 Molecular structure of florfenicol

目前氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留的檢測主要以高效液相色譜等理化分析方法為主［5－6］，其檢測靈敏度分別為0.03～0.1×10－6，但其樣本處理復雜，儀器操作難度較高，因此不適于大量樣品的快速檢測．酶聯免疫檢測是一種基于抗原抗體特異性反應的免疫學方法，簡便易于操作，且具有靈敏度高，特異性好等特點，已經在獸藥殘留檢測領域廣泛應用，我國農業部也公布了一系列以酶聯免疫檢測方法為檢測手段的國家標準，酶聯免疫技術已經超出了一般的快速篩選方法的范疇．本研究即著手建立一種氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留的酶聯免疫檢測方法．

1 材料和方法

1.1 主要試劑及實驗動物

氟苯尼考、氟苯尼考胺、甲砜霉素和氯霉素標準品，美國Sigma公司;牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA，美國Sigma公司;羊抗兔HRP標記二抗，上海西寶生物;酶標板，Costar公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑由本單位自行配制;其他常規試劑購自于北京化學試劑公司．

實驗用新西蘭大白兔來自于國家獸藥安全評價中心實驗動物房．

1.2 主要實驗儀器

MK3型酶標儀，芬蘭雷伯公司;TD5型離心機，上海安亭公司;DSY-III型氮吹儀，北京東方精華苑公司;QL-901型渦旋混合儀，江蘇希望公司;其余為常規儀器．

1.3 檢測方法的建立和評價

1.3.1 氟苯尼考抗原的制備

將氟苯尼考胺和BSA通過碳化二亞胺法偶聯得到免疫原(FF-BSA)，制備過程為:將氟苯尼考胺10 mg溶解于1 mL水中(溶液I)，取BSA 50 mg用5 mL水溶解后加入溶液I中，再加入EDC 25 mg攪拌反應過夜，即得到免疫原FF-BSA．包被原是將氟苯尼考胺半抗原和卵清蛋白采用EDC法進行偶聯得到的，其制備過程為:取氟苯尼考胺5 mg用0.5 mL水溶解(溶液I)，取25 mg的EDC加入溶液I中，活化反應30 min，取卵清蛋白20 mg用2.7 mL水溶解后加入，攪拌反應過夜，即得到包被原(FF-OVA)．

1.3.2 氟苯尼考胺多克隆抗體的制備及評價

采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以FF-BSA作為免疫原，免疫劑量為1.0 mg/kg體重．首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑．10天后采血，測定血清抗體效價，經飽和硫酸銨純化得到多克隆抗體．用常規間接ELISA方法檢測制得的抗體的效價及其與氟苯尼考、氟苯尼考胺、甲砜霉素、氯霉素的交叉反應率，對其特異性進行評價．

1.3.3 酶聯免疫檢測方法的建立

1.3.3.1 標準曲線的建立

用1.3.2實驗制備的抗原抗體，已測定的抗體效價結果為基礎，通過優化加樣方式和時間，對不同濃度標準點的曲線進行回歸分析標價，建立間接競爭ELISA方法的標準曲線．

1.3.3.2 酶標板的制備

優化不同的包被緩沖液和包被時間，建立最佳的包被條件．

1.3.3.3 動物組織樣本的處理方法

優化不同的有機試劑及其提取時間，建立回收率最好的樣本前處理方法．

1.4 檢測方法的評價

1.4.1 樣本最低檢測限的測定

對空白樣本分別進行20次檢測，測定結果的平均值加上3倍標準差作為樣本的最低檢測限．

1.4.2 陰性樣品添加回收率的測定

取2個濃度的氟苯尼考胺標準品溶液20，50 μg/kg，分別對樣品進行添加回收實驗，每個濃度做4個平行，分別計算準確度．

1.4.3 精密度測定

分別從3個不同的時間段制備的酶標板中各抽出一批酶標板，每批各抽取10個試劑盒，每板各抽出20個微孔，測定4.5 μg/L標準溶液的吸光度值，計算變異系數．

2 結果與討論

2.1 抗原的制備

獸藥抗生素類多數為小分子，沒有免疫原性，不能刺激動物產生抗體，需要與大分子如BSA、OVA等進行偶聯，增強其免疫原性，才能產生效價較高的抗體．本研究利用氟苯尼考胺中的胺基通過碳化二亞胺法與BSA、OVA進行偶聯得到免疫原和包被原．對制備得到的偶聯抗原進行紫外掃描，按照如下公式計算偶聯比，具體操作過程為:準確稱取A、B兩種物質，用PBS緩沖液配成確切濃度的溶液，另取少量的偶聯物，用相同的PBS稀釋．分別用紫外掃描測定這3種溶液在A和B 2種物質最大吸收峰波長處的吸光度值(即 AAam、AAbm、ABam、ABbm、ACam、ACbm)，同時根據A和B物質的濃度分別計算KAam、KAbm、KBam、KBbm)，例如

經計算得到FF與BSA和OVA的偶聯比(Ca/Cb)分別為12∶1和 14∶1，故證明偶聯成功．

2.2 多克隆抗體的制備及評價

2.2.1 抗體效價的測定結果

通過效價測定，本實驗制備的兔抗氟苯尼考多克隆抗體的效價在1∶40 000．

2.2.2 抗體交叉反應測定

選擇與氟苯尼考胺有類似結構和類似功能的3種藥物測定交叉反應率，結果如表1．

表1 氟苯尼考多克隆抗體交叉反應測定Tab．1 Cross-reactivity determination of florfenicol polyclonal antibody

2.3 ELISA檢測方法的建立及評價

通過常規反應模式建立ELISA方法，并對其進行評定［7］．

2.3.1 標準曲線的建立

通過預實驗，最終選定質量分數為0，0.5，1.5，4.5，13.5，40.5 μg/kg 的氟苯尼考胺標準品建立雙對數模型標準，如圖2．

所建立的曲線線性方程為y=0.517 339－2.203 74x，其中x為氟苯尼考胺標準品濃度的對數值

式中A為不同濃度對應的吸光度值，A0為0標準品濃度對應的吸光度值，方程相關系數絕對值大于0.99．

圖2 氟苯尼考胺多克隆抗體標準曲線Fig．2 Standard curve of florfenicol based on polyclonal antibody

2.3.2 建立ELISA檢測方法

2.3.2.1 酶標板的制備

通過實驗，最終確定的包被條件為:用包被緩沖液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)將FF-OVA稀釋成0.06 ～0.1 μg/mL，每孔加入 100 μL，37 ℃孵育 2 h后，傾去包被液，用PBS-T洗板2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μL封閉液(含有0.5%OVA的PBS)，37℃溫育2 h，傾去孔內液體，干燥后儲存備用．

2.3.2.2 樣本前處理方法的確定

通過對實驗條件的優化確定最終的樣本前處理方法為:稱取3 g均質后的組織樣本到50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6 mL乙酸乙酯，用振蕩器振蕩10 min，3 000 g以上，室溫(20 ～25 ℃)離心10 min;移取4 mL上層有機相至10 mL干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣吹干，加入1 mL正己烷，用渦旋儀渦動1 min，再加1 mL復溶工作液，用渦旋儀渦動10 s，3 000 g以上，室溫離心10 min;除去上層有機相，取下層50 μL用于分析．

向制備好的酶標板微孔中加入氟苯尼考胺標準品溶液或樣本溶液50 μL，再加入氟苯尼考胺抗體工作液50 μL，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應30 min，倒出孔中液體，每孔加入250 μL洗滌液，30 s后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干．加入酶標二抗100 μL，37℃恒溫箱中反應30 min，倒出孔中液體，重復洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯苯胺，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15 min后，加入2 mol/L終止液硫酸50 μL，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定吸光度值．

2.3.3 評價ELISA方法

2.3.3.1 樣本最低檢測限的測定

通過對20份空白樣本進行了檢測，結果如表2，表明所建方法最低檢測限為0.5 μg/kg．

表2 空白樣品測定結果統計表Tab．2 Results of blank sample measurement μg/kg

2.3.3.2 陰性樣品添加回收率的測定

氟苯尼考在畜牧、水產等領域中均有應用．本研究僅以豬肉樣本為例進行說明，考慮到魚、蝦等水產品脂肪含量較高，實際操作時還需去脂，對方法進行優化才能進行檢測．以豬肉樣本為例進行添加，結果見表3．

結果表明各樣本以20，50 μg/kg氟苯尼考胺添加回收率均在82.5%～96.0%．

2.3.3.3 精密度測定

精密度測定結果見表4．

表3 試劑盒的準確度Tab．3 Percent of accuracy of kit

表4 ELISA方法精密度測定結果Tab．4 Precision measure results of ELISA method%

由表4可知，3批酶標板對4.5 μg/L標準品的測定結果的變異系數在4.1% ～15.2%，符合精密度小于或等于20%的規定．

3 結論

本研究通過合成氟苯尼考半抗原及抗原，制備了兔多克隆抗體．通過對抗體進行評測和方法優化建立了一種氟苯尼考的ELISA快速檢測檢測方法．該方法最低檢測限為 0.5 μg/kg，以 20，50 μg/kg 進行空白樣品添加實驗時回收率為82.5%～96.0%，批間變異系數在4.1% ～15.2%，可以初步用于動物組織中氟苯尼考殘留的檢測．

［1］孫豐云，張素霞，沈建忠，等．蝦肉中氯霉素甲砜霉素氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留氣相色譜—微電子捕獲檢測法［J］．中國獸醫雜志，2006，42(10):66-67．

［2］孫澤祥，楊挺，鮑偉華，等．雞組織中氟苯尼考和氟苯尼考胺代謝動力研究［J］．試驗研究，2009，21(8):21-23．

［3］邱銀生，吳佳．獸用廣譜抗菌藥物氟甲砜霉素［J］．中國獸藥雜志，1996，30(2):47-48．

［4］Ueno R，Terakado H，Aoki T．Determination of florfenicol in cultured yellowtail by high performance liquid chromatography［J］．Bull Fac Bioresour Mie Univ，2000，24:23-29．

［5］Tamoko N，Hisao O．Detection of residual chloramphenicol，florfenicol，and thiamphenicol in yellow tail fish muscle by capillary gas chromatographt-mass spectrometry［J］．J Agric Food Chem，1996，44:1280-1284．

［6］魏海濤，方秋華，曾振玲，等．高效液相色譜法測定豬血漿中氟苯尼考的含量［J］．廣東畜牧獸醫科技，2010，35(3):31-33．

［7］萬宇平，吳鵬，馮月君，等．食品中磺胺類藥物化學發光酶聯免疫檢測試劑盒的初步研究［J］．北京工商大學學報:自然科學版，2012，30(2):27-34．

(責任編輯:李 寧)

Detection of Florfenicol Residues by Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FENG Cai-mao， JIA Yu， MA Xiao-bin， ZHANG De-hong
(Beijing Kwinbon Biotechnology Co．Ltd．，Beijing 102206，China)

The structure of florfenicol was transformed to prepare the hapten antigen and antigen，the polyclonal antibody was obtained by immunized rabbit．The determination of the antibody showed high sensitivity and have reactions on florfenicol and florfenicol amine，the titer was 1∶480000．On this basis，the indirect competitive ELISA method was established through the optimization of the parameters．The detection limit of the established ELISA method was 0.5 μg/kg，the sample recovery was 82.5%to 96.0%by 20，50 μg/kg addition to the blank experiment，and the inter-assay coefficient ranged from 4.1%to 15.2%．The method could be used for preliminary detection of florfenicol residues in animal tissue samples．

florfenicol;antigen preparation;enzyme-linked immunosorbent assay

TS201.6;S859.84

A

1671-1513(2012)04-0050-04

2011-12-20

馮才茂，男，工程師，主要從事食品安全檢測方面的工作;

賈 瑜，女，碩士，主要從事食品安全檢測方面的工作．通訊作者．