基于宏基因組方法對西藏傳統發酵牦牛奶中微生物多樣性的研究

孫志宏， 劉文俊， 張和平

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018)

基于宏基因組方法對西藏傳統發酵牦牛奶中微生物多樣性的研究

孫志宏， 劉文俊， 張和平

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018)

采用454高通量測序技術從宏基因組角度對西藏地區自然發酵牦牛奶中微生物多樣性進行分析，以細菌16S rRNA的V3區和真菌的ITS區序列為擴增、測序靶點，分別獲得3 051和3 396條高質量序列．研究發現，西藏自然發酵牦牛奶樣品中真菌的豐度要大于細菌．在門的水平上，細菌和真菌分別由硬壁菌門(Firmicutes)和子囊菌門(Ascomycota)組成，而在屬的水平上細菌和真菌的優勢菌分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)和耐堿酵母屬(Galactomyces)．

自然發酵牦牛奶;微生物多樣性;454測序

酸牦牛奶(Kurut)是我國西藏地區由藏民制作的一種自然發酵乳制品，是青藏高原地區藏民重要的飲食和經濟來源．Kurut呈純白色、黏稠狀，通常在10～20℃的自然環境中發酵3～6 d，產生具有酸度和酒精混合所特有的味道［1］．其脂肪含量為5.37%，總蛋白含量約5.44%，平均大約是酸奶中脂肪和蛋白質含量的2倍．同時Kurut中鈣(140 mg/100 g)、磷(146 mg/100 g)、鎂(154 mg/100 g)、鋅(5.74 mg/100 g)和B族維生素含量均高于普通酸奶［2］．由于Kurut具有理想的營養成分以及特有的口感，許多研究機構不斷模仿并設計該產品的生產加工工藝，以期產業化這一發酵乳制品．

全面深入地了解微生物多樣性以及菌群組成是酸牦牛奶首要解決的問題．Kurut中的微生物主要是由乳酸菌和酵母菌組成，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)同樣也是其主要的發酵劑成分［1－2］．然而，關于發酵乳中微生物多樣性及群落研究大多局限于傳統的純培養方法，這種方法雖然可以分離到部分微生物，但是由于培養條件的局限性，不能完全分析樣品中微生物的組成，往往會低估了微生物多樣性．

隨著分子生物學技術的不斷發展，基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術出現了許多非培養的方法，像16S rRNA克隆建庫、DGGE/TGGE以及芯片等方法被廣泛應用于發酵食品和其他微生態環境中微生物多樣性的研究．平行高通量焦磷酸測序技術(parallel high throughput pyrosequencing)是 Margulies等［3］優化改良焦磷酸測序技術后應用到微生物的多樣性分析技術．由于其具有高通量、快速等優點，該方法一經出現就被廣泛應用于各種生態系統中，比如深礦井，土壤，深海生物圈，慢性創傷部位、人類口腔和腸道等微生態環境中微生物多樣性的檢測和研究中．近年來，焦磷酸測序也逐漸應用到傳統發酵食品中微生物的多樣性研究，如開菲爾粒［4－6］、珍珠粟漿［7］、干酪［8］等發酵食品．

本研究以采集自我國西藏地區的2份自然發酵牦牛奶(酸牦牛奶)為研究材料，通過焦磷酸測序完成對樣品中細菌以及真菌的多樣性分析，全面了解自然發酵牦牛奶中微生物組成，為加快酸牦牛奶產業化提供理論基礎．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發酵牦牛奶樣品XZ15和XZ16分別采集自西藏那曲縣羅馬鎮和西藏當雄縣納木錯(平均海拔4 300 m以上)的牧戶．

PCR引物由上海桑尼生物科技有限公司合成．Taq酶(DR001C)由寶生物工程(大連)有限公司提供．

1.2 儀器與設備

5810R型冷凍離心機，德國 Eppendorf公司;GDS-8000型凝膠成像儀，美國UVP公司;DYY-12型電泳儀，北京六一公司;PTC-200型梯度PCR擴增儀，美國伯樂公司;2100型生物分析儀，美國安捷倫公司;Roche GS FLX型測序儀，美國Roche 454公司．

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

采用CTAB-SDS凍融法提取樣品中微生物宏基因組DNA．依據張春林等［9］的方法并進行了適當的調整．取1 mL發酵乳樣品于7 mL離心管中，立即置于液氮中完全凍結，取出后放入65℃水浴中融化(5 min)，反復3次，而后加3 mL DNA提取液(100 mol/L Tris-HCl;100 mmol/L EDTA;100 mmol/L Na2HPO4;1.5 mol/L NaCl，1%CTAB，pH 8.0)混合，然后加0.3 mL SDS(10%)和10 μL 蛋白酶K(10 mg/mL)，于50℃恒溫搖床中100 r/min搖動2 h，然后室溫下10 000 r/min離心10 min，收集上清轉移至另一離心管中，離心管中其余沉淀再加入0.9 mL DNA提取液和0.1 mL 20%SDS，渦旋10 s，65℃水浴5 min，于液氮中冷凍、65℃融化，反復3次重復上述操作，收集上清液與前一次合并．上清液與等體積的氯仿于10000 r/min離心10 min，吸取上清液轉移至另一離心管中，加入等體積的V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，輕輕混勻 2 min，室溫12 000 r/min離心5 min，收集上清液加入0.1倍體積的NaAc，輕柔混勻，加入1倍體積的冰異丙醇，混合、靜置2 min，于12 000 g離心5 min沉淀DNA，然后加入70%乙醇洗滌沉淀，沉淀自然風干后，重懸于20 μL滅菌的去離子水中冷藏備用．

1.3.2 16S rRNA V3區PCR擴增及焦磷酸測序

為了能夠把2個樣品放在一次測序中完成，在引物的5'段加6個堿基的barcode(見表1)來區分樣品．PCR擴增反應體系為1×PCR緩沖液(含有2.5 mmol·L－1MgCl2)、上下游引物 3 pmol、dNTPs 200 mmol·L－1和 1 μL 50 ng/μL 提取的 DNA 模板，用水補齊到50 μL．擴增循環條件為94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環30次．擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后，通過產物純化、安捷倫2100生物分析儀定量混勻，上樣測序．焦磷酸測序按照454 Roche GS-FLX的標準流程進行測試．

表1 所用PCR引物Tab．1 PCR primer used in this study

1.4 數據分析

獲得的數據提取高質量序列、劃分操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)等依據Mothur程序包［10］來完成．原始數據需要經過質量控制，需滿足序列引物和Barcode序列完全匹配、序列長度大于150 bp、序列中不存在有爭議的堿基、多聚體結構不得超過7個、每50個堿基質量值平均不低于35．通過序列的聚類以給定非相似度(cutoff)0.03水平上劃分OTU，選用每一OTU代表序列進行注釋，采用BLAST比對方法細菌于SILVA數據庫［11］進行注釋，真菌于UNITE數據庫［12］進行注釋．系統發育樹構建由Megan程序包［13］依據OTU注釋信息完成．

2 結果與分析

2.1 豐度和多樣性分析

通過454高通量測序，XZ15號酸牦牛奶樣品得到的高質量細菌和真菌序列分別為1 626條和2 101條，XZ16號樣品為1 425條和1 295條．在給定非相似度97%的水平上進行OTU歸并，XZ15和XZ16號樣品分別得到32個和9個細菌OTU，63個和48個真菌OTU．兩個酸牦牛奶樣品細菌和真菌的稀疏曲線(rarefaction curves)均未進入平臺期(見圖1)，這就意味著隨著測序量的增加，新的細菌或者真菌種系將被發現．同時也表明XZ15酸牦牛奶樣品其細菌和真菌的豐度要明顯高于XZ16樣品．2011年，Dobson等［4］采用焦磷酸測序對3個開菲爾粒樣品的細菌組成進行分析，平均每個樣品產生了5 805條序列，其結果表明已進入平臺期．結合本研究結果，指示出后期實驗還應進一步提高測序量，以盡可能的分析樣品中微生物的組成．

圖1 兩個酸牦牛奶樣品中細菌和真菌的稀疏曲線Fig．1 Rarefaction analysis of pyrosequencing reads in bacteria and fungi from two Kurut samples

通過chao1指數對樣品的豐度進行比較，XZ15號和XZ16號酸牦牛奶樣品中細菌的chao1指數分別為58和16.5，真菌分別為129.1和130.7．由此可見，兩份酸牦牛奶中真菌的含量均大于細菌，且XZ15號樣品中細菌的含量要遠大于XZ16號樣品，而其真菌含量比較接近．通過simpson指數對樣品的多樣性進行比較，XZ15號和XZ16號酸牦牛奶樣品中細菌的simpson指數分別為2.058和1.030，真菌分別為1.806和1.735．由此可見，XZ15號酸牦牛奶中雖然真菌的含量大于細菌，但其多樣性和細菌相近，而XZ16號樣品中細菌的含量和多樣性均低于真菌．這與張春林［9］、Airidengcaicike［14］等報道kurut中真菌含量大于細菌的結論不同，可能是由于采用純培養技術對真菌培養方法單一而致．

2.2 樣品中微生物相對含量的比較分析

通過OTU的劃分，選取出現次數較多的序列為一個OTU的代表序列，采用BLAST的比對方法完成序列的注釋和分類學地位的確定．XZ15酸牦牛奶中的細菌分別屬于硬壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)3個細菌門，其含量分別為80.1%，12.9%和6.9%;而XZ16樣品中的細菌分別屬于硬壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，其含量分別為99.8%和0.2%，參見圖2、圖3．

由圖2、圖3知，兩個酸牦牛奶樣品中的細菌主要隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)．在屬的水平上，XZ15酸牦牛奶中的細菌分別隸屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串球菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、嗜熱鏈球菌屬(Streptococcus)和魏氏菌屬(Weissella)等6個細菌屬，其含量分別為 72.3%，7.0%，0.1%，0.1%，0.5%和0.2%;XZ16酸牦牛奶中的細菌分別隸屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)和嗜熱鏈球菌屬(Streptococcus)3個屬，其含量分別為98.7%，0.1%和1.0%．由此可見，乳桿菌屬(Lactobacillus)是兩份酸牦牛奶中的優勢菌屬．此外，比較細菌的相對含量不難發現，XZ15酸牦牛奶樣品中細菌的多樣性要大于XZ16．Airidengcaicike等［14］通過傳統的純培養手段發現西藏地區酸牦牛奶中優勢菌群為發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，與本研究取得結果一致．

圖2 兩個酸牦牛奶樣品中細菌的組成Fig．2 Compositions of bacteria in two Kurut samples

圖3 兩個酸牦牛奶樣品中細菌相對含量的比較Fig．3 Relative abundance(percentage of sequences)of bacteria in two Kurut samples．

XZ15號酸牦牛奶中共發現14個真菌屬，其中含量大于1%的真菌屬分別為耐堿酵母屬(Galactomyces)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)和雙足囊菌屬(Dipodascus)，其含量分別為84.2%，8.0%，2.5%和2.0%;XZ16號酸牦牛奶中共發現10個真菌屬，其中含量大于1%的真菌屬分別為耐堿酵母屬(Galactomyces)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)和酵母屬(Saccharomyces)，其含量分別為79.3%，17.2%和1.0%，參見圖4、圖5．

圖4 兩個酸牦牛奶樣品中真菌的組成Fig．4 Compositions of fungus in two Kurut samples

由圖4、圖5可見，耐堿酵母屬(Galactomyces)是2份酸牦牛奶中的優勢真菌屬，其次為克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)．倪慧娟等分析了新疆地區酸馬奶［15］、酸駝乳［16］中酵母菌的多樣性，其結果都表明克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)和酵母屬(Saccharomyces)是2種自然發酵乳的優勢菌屬．造成不同優勢菌群的主要原因可能是樣品來源不同、環境不同而造成．早在1996年，Montanari等［17］對來自不同地區的94份酸馬奶樣品進行了酵母菌分離鑒定后，發現多數樣品中含有單孢酵母(Saccharomyces unisporus)，并且它的數量隨海拔位置的提高而增加，是傳統酸馬奶酒精發酵的主要微生物之一．本研究樣品均采自海拔4 300 m以上自然發酵牦牛奶，可能耐堿酵母屬(Galactomyces)更加適應當地的環境，經歷了不斷進化地選擇，逐漸形成了西藏自然發酵牦牛奶的優勢菌屬．同時基于純培養技術可能由于培養條件的限制，導致傳統方法分析的菌群也具有片面性．

圖5 兩個酸牦牛奶樣品中真菌相對含量的比較Fig．5 Relative abundance(percentage of sequences)of fungus in two Kurut samples

3 結論

本研究采用高通量測序技術對西藏自然發酵牦牛奶的微生物多樣性及組成進行了分析，第一次從宏基因組水平對傳統發酵牦牛奶中的微生物菌群進行探討．研究發現，酸牦牛奶樣品細菌的優勢菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)，真菌的優勢菌為耐堿酵母屬(Galactomyces)，其中真菌的豐度要大于細菌．通過測序分析，不僅證實了前期采用基于純培養方法的部分研究結果，也發現了以前未曾報道的現象，如真菌的含量以及多樣性差異、細菌多樣性等，均表明通過高通量測序可更全面地分析自然發酵牦牛奶中微生物的多樣性．同時通過本研究，更加全面地了解了發酵牦牛奶的微生物組成和多樣性，為加快這一傳統發酵乳的產業化進程提供基礎數據．

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(責任編輯:檀彩蓮)

Study on Microbial Diversity in Naturally Fermented Yak Milk of Tibet Based on Metagenomics

SUN Zhi-hong， LIU Wen-jun， ZHANG He-ping
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agriculture University，Huhhot 010018，China)

In this study，the microbial diversity of metagenomics in naturally fermented yak milk(kurut)were investigated using barcoded pyrosequencing．A total of 3 051 unique V3 variable regions of the 16S rRNA gene of bacterium and 3 396 unique ITS variable regions of fungi were analyzed from two kurut samples．The results indicated that the abundance of fungi was higher than bacteria in the kurut samples．The Firmicutes and Ascomycota were the most abundant bacteria and fungi phyla in kurut samples．At genus levels，the bacteria of kurut were largely composed of the Lactobacillus while Galactomyces was the dominant genus within the fungus of kurut．

naturally fermented yak milk;microbial diversity;454 pyrosequencing

TS201．3

A

1671-1513(2012)04-0019-06

2012-06-15

國家杰出青年基金資助項目(31025019);教育部創新團隊發展計劃資助項目(IRT0967)．

孫志宏，男，助理研究員，碩士，主要從事乳酸菌分子生物學方面的研究;

張和平，男，教授，博士，主要從事乳品生物技術方面的研究．通訊作者．

編者按:微生物在乳制品的生產和貯藏過程中起著至關重要的作用．為了提高乳制品的品質和營養特性，一方面要全面掌握傳統發酵乳制品的微生物特性，進而篩選、強化有益菌的作用;另一方面要采用現代乳制品高新加工技術抑制腐敗菌的生長，達到保持營養品質、延長貨架期的目的．在“基于宏基因組方法對西藏傳統發酵牦牛奶中微生物多樣性的研究”一文中，通過焦磷酸測序對我國西藏地區的傳統發酵牦牛奶中細菌、真菌的多樣性進行分析，從宏基因組水平對傳統發酵牦牛奶中的微生物菌群進行探討，證實了真菌豐度大于細菌的現象，為加快酸牦牛奶產業化提供了基礎數據．在“不同貯藏溫度對UHT乳品質的影響”一文中，研究了采用超高溫瞬時滅菌之后液態奶的品質變化，分析不同貯藏溫度和時間下UHT乳蛋白質水解、脂肪氧化等指標的變化規律，探討造成UHT乳品質變化的根本原因，以期為UHT乳的運輸、銷售及貯藏環境的選擇提供理論依據和參考．(欄目主持人:張德權研究員)