固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因多態性與肉用性狀關系的研究

滑留帥，楊曉冰，楊 奇，胡沈榮，陳 宏＊

引言

固原市位于寧夏回族自治區南部山區，是一個歷史悠久的肉?；?。固原本地的黃牛品系，基本是陜西秦川牛的后裔或直接從陜西引進的秦川牛，以役用為主。上個世紀70年代，政府開始有組織的進行黃牛雜交改良，先后引進過短角牛、西門塔爾牛等國外優良品種進行雜交改良，但推廣范圍都有限。2000年以后，固原市推行退耕還林還草政策，并把草畜產業作為第一支柱產業，大力推廣利木贊牛的雜交改良，目前已有很大的利木贊牛雜交群體。

脂肪酸結合蛋白（fatty acid－binding proteins，FABPs）是一族分子質量為14kD～16kD的蛋白質，廣泛存在于哺乳動物的小腸、肝、心、腦和骨骼肌等多種細胞內，并且含量豐富［1］，目前，已發現9種組織特異性的胞質FABP，其中 H－FABP（heart fatty acid－binding proteins，H－FABP）對動物脂肪代謝有重要作用，H－FABP在細胞內與脂肪酸結合，使細胞內外保持一定的脂肪酸濃度差，促進細胞攝取脂肪酸［2，3］，H－FABP基因敲除小鼠表現出對外圍長鏈脂肪酸利用的嚴重缺陷。FABP家族成員還與細胞生長和增殖的調節有關，H－FABP能調節新生小鼠心肌細胞的生長和分化、它還能刺激細胞表面積的增加，從而導致心肌細胞的肥大［4］；而且，H－FABP尤其抑制小鼠正常乳房上皮細胞的生長，H－FABP還被認為是乳房腫瘤的抑制基因。種間H－FABP基因編碼區有很高的同源性，這不僅表現在所編碼的氨基酸上，還表現在DNA序列上［5］。所有FABP基因家族成員基因結構都是保守的，有4個外顯子和3個內含子組成［6］，研究證實H－FABP基因是影響脂肪性狀的主要候選基因［7］，從而對肉品質有重要影響，由于其影響脂肪代謝，并同時推測其對動物的生長發育也存在影響。

本研究利用PCR－RFLP研究了固原本地黃牛及其利木贊牛雜交群體H－FABP－HaeIII位點多態性及其與屠宰性狀和肉品質性狀的關系，以期為固原本地黃牛下一步的雜交改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為隨機抽取的41頭固原本地黃牛和121頭利木贊牛與固原本地黃牛的雜交1代牛（簡稱利雜牛），頸靜脈采血，ACD抗凝，－80℃保存。然后在其中選取18月齡和6月齡利雜牛公牛各6頭，18月齡和6月齡固原本地公牛各6頭，共計24頭進行6個月的育肥試驗后，進行屠宰性能測定和肉品質測定。屠宰試驗在寧夏六盤山涇河清真食品有限公司進行。

1.2 主要試劑

蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶HaeIII等購自MBI（Fermantas）和上海生物工程有限公司。

1.3 固原本地黃牛及其利雜群體基因組DNA的提取

血樣基因組DNA的提取采取酚氯仿法［8］。

1.4 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因的PCR擴增

引物序列參考文獻［13］，上游序列5′－ AGCCTACCACAATCATCGAAGTGAA －3′；下游序列 5′－ CAAGTGATGTCTCTTGTCCATTCCA－3′，由上海生物工程公司合成。PCR反應體系為25μL：10×Buffer 2.5μL，MgCl2（25mmol／L）2.0 μL，dNTPs（2.5mmol／L）2.0μL、Taq DNA 聚合酶（2U／μL）0.5μL，上下游引物（10pmol／μL）各0.4μL，模板 DNA（50ng／μL）1.5μL，加三蒸水至25μL。PCR反應程序為：95℃預變性5min，（94℃變性30s，65℃復性45s，72℃延伸1min）34個循環，最后72℃延伸10min。

1.5 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR－RFLP分析

圖1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR產物電泳圖

酶切反應體系：10×緩沖液R（含BSA）2μL，HaeⅢ（10U／μL）0.7μL，PCR產物10μL，補三蒸水至20μL，經瞬時離心后置于37℃恒溫水浴搖床中消化過夜，消化后PCR產物用4g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測、成像。

1.6 數據分析

基因型與基因頻率、適合性χ2檢驗均利用POPGENE軟件完成。與生產數據的相關分析采用最小二乘線性模型，不同育肥階段的方差分析模型如下：Y＝μ＋breed＋marker＋e其中：Y為個體表型的記錄值；μ為群體平均值；breed為品種效應；marker為標記基因型效應；e為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因的PCR－RFLP分析

固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR產物片段大小為2 075bp（圖1），用 HaeIII限制性內切酶消化后表現多態性（圖2，只顯示部分多態片段）：AA型表現為7條帶，片段大小分別為73 bp、124bp、146bp、169bp、312bp、599bp、653bp，BB型表現為8條帶分別為73bp、124bp、146bp、169bp、166bp、312bp、487bp、599bp，即在 AA型中的653bp的片段在BB型中被切為166bp和487 bp，AB型表現為9條帶，分別73bp、124bp、146 bp、169bp、166bp、312bp、487bp、599bp、653bp，即在雜合子中所有片段大小的帶都出現。然而僅就487bp、599bp、653bp三條帶就能將牛進行分型（圖2）。

2.2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座的遺傳多態性分析

固原本地黃牛及其利雜群體的H－FABP基因座經HaeIII的酶切后表現多態性，且均在該位點處于Hardy－Weinberg平衡狀態；等位基因A／B頻率分別為0.7439／0.2561和0.7190／0.2810，利雜群體位點雜合度、多態信息含量、有效等位基因數均大于固原本地黃牛群體。

圖2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座酶切電泳圖

表1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座的遺傳多態性指標

2.3 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座不同基因型與部分屠宰性狀和肉品質性狀的關聯分析

考慮品種效應、標記基因型效應及其它們之間的互作，在不同年齡階段對屠宰性狀和肉品質性狀進行兩因素方差分析，由表2可知：AB型個體的心重大于AA型個體，差異顯著（P＜0.05）；而腎脂肪重、脂肪色澤評分、眼肌面積、系水力、粗脂肪含量，AB型個體均高于AA型個體，同時AB型個體的肌肉剪切力、粗蛋白含量小于AA型個體，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座基因型間最小二乘均值差異顯著性檢驗

3 討論

固原本地黃牛及其利雜群體的H－FABP基因座經HaeIII的酶切后表現多態性，且均在該位點處于Hardy－Weinberg平衡狀態，說明在這個位點受到的選擇壓力不大，這可能是因為H－FABP基因與脂肪性狀或肉品質性狀相關，而這些性狀都是不太容易測量的，所以在選種時，選擇強度可能不大，目前在肉牛業越來越重視肉品質的趨勢下，應該在以后的選種過程中加大選擇的力度，提高群體的肉品質水平。利雜群體位點雜合度、多態信息含量、有效等位基因數均大于固原本地黃牛群體，說明用利木贊牛的雜交改良豐富了固原本地黃牛在該位點上的遺傳資源，為后期的選種工作提供了更豐富的素材，同時，用利木贊牛的雜交改良提高了固原本地黃牛群體中B等位基因的基因頻率。

脂肪酸結合蛋白（fatty acid－binding proteins，FABPs）在脂肪酸生成過程中具有重要的生物學功能，參與細胞內脂肪酸的運輸，調整細胞內脂肪酸的濃度。它們能在心肌和脂肪細胞中沉積甘油三酯，這是增加肌內脂肪含量（intramuslar Fat，IMF）的主要方向，10%左右的IMF可產生理想的大理石花紋，從而形成優質高檔牛肉［9］。據研究，牛肉大理石花紋性狀與牛肉的嫩度高度相關，較高水平的大理石花紋可以提高牛肉的嫩度、多汁性和風味，減少牛肉在烹調過程中嫩度的變化。目前對H－FABP基因的研究多集中在豬上和雞上，少數涉及牛，Gerbens等［10］利用侯選基因法的研究表明H－FABP基因的遺傳變異與肌內脂肪含量存在相關，在杜洛克豬中存在MspI、HaeIII和HinfI酶三個多態性酶切位點，并初步發現H－FABP基因的純合單倍體“aa dd HH”與高肌內脂肪含量相關，H－FABP基因被認為是影響肌內脂肪沉積的主效基因。龐衛軍等（2005）報道，利用 PCR－RFLP（MspI、HaeIII和HinfI3種限制性內切酶）分子標記技術，檢測了杜洛克豬、長白豬、大白豬、內江豬、榮昌豬、漢江黑豬、漢中白豬、八眉豬和野豬共計265頭豬H－FABP基因5＇－上游區和第二內含子區的遺傳變異，并利用最小二乘模型分析了H－FABP基因對豬肌內脂肪含量的遺傳效應。結果表明，H－FABP基因可顯著地提高IMF含量（P＜0.05），可以通過提高“aa－dd－HH”基因型的頻率達到改善群體豬肉質的目的［11］。李文娟等（2006）利用RT－PCR和實時熒光定量PCR技術，分析了H－FABP基因與雞肌內脂肪沉積的關系，結果表明，H－FABP基因mRNA隨日齡的增長表達量顯著降低，北京油雞、白萊航雞和AA雞群體的H－FABP基因mRNA表達水平與IMF含量及胴體重呈現顯著的負相關［12］。周國利等［13］報道，魯西黃牛H－FABP基因中BB純合基因型對牛肉嫩度剪切力值有較大的影響（P＜0.05），同時，對于腎脂肪重、脂肪色澤評分、眼肌面積、系水力等指標，AB型均高于AA型，在本試驗研究的群體中，除心重指標AB型顯著大于AA型（P＜0.05）外，基因型對腎脂肪重、脂肪色澤評分、眼肌面積、肌肉嫩度、系水力、肉品粗脂肪含量等指標均影響不顯著，但都呈現AB基因型優于AA型的趨勢，初步認為B等位基因與優良生產性能相關。本研究因為樣本量限制，沒有檢測到BB型個體，應該進一步擴充樣本量，使BB型數量到可統計的水平，以提高研究的準確性。

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