手機微波輻射對豚鼠耳蝸外毛細胞膜電位的影響△

馮曉華 龍孝斌 汪建 陳勇挺

目前，手機通訊已成為人們信息交流的主要工具之一，其電磁微波輻射可能對人們的健康構成潛在的威脅。近年來，手機微波輻射對大腦及中樞神經系統可能產生的影響備受研究者關注［1］。本研究擬通過建立模擬手機微波輻射豚鼠模型，分離豚鼠單個活的耳蝸外毛細胞（outer hair cell，OHC），在2 000Hz不同強度的純音刺激下，觀察單個離體豚鼠耳蝸OHC膜電位的變化及規律，探討手機微波輻射對聽覺功能可能產生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用成年健康雜色豚鼠20只，體重280～350g，雌雄不分，耳廓反射正常，由南方醫科大學實驗動物中心提供。豚鼠適應性喂養10天后，隨機分為對照組、輻射組，每組各10只。

1.2 檢測儀器 ACAS 570 粘附式細胞儀（美國Meridian公司生產）；丹麥產Madson純音測聽儀；DIBAC4（3）熒光探針（美國Sigma公司產品，細胞膜特異性熒光探針）。

1.3 手機微波輻射裝置及輻射方法 手機通信頻率為900 MHz，功率密度為0.05 mW／cm2。將輻射組豚鼠限制于自制的籠中，將手機聽筒放置于豚鼠的耳部，距離豚鼠耳廓2cm，以便及時調整并模擬人通話的狀態。接通手機后輻射時間分別為1、6、12、24和48h（各2只豚鼠），對照組豚鼠除不進行手機輻射外，其余處理均與輻射組相同。

1.4 實驗溶液的配制

1.4.1 Hepes 液的配制（mmol／L） NaCl 133，KCl 5.4，Hepes 5，Glucose 5，CaCl21.3，MgSO40.9，配制時準確稱量后采用三蒸水配制，用1N 的NaOH 調節pH 至7.4，4mol／L NaCl將其滲透壓調節為300mmol／L。

1.4.2 IV 膠原酶液的配制 采用美國Sigma公司生產的IV 膠原酶，用Hepes液配制成濃度為0.5 mg／ml備用。

1.4.3 多聚賴氨酸粘附劑的配制 采用美國Sigma公司生產的多聚賴氨酸（poly－1－lysine），用三蒸水配制成0.25mg／ml溶液，取50μl加入ACAS 570專用培養皿中，無菌條件下風干備用。

1.4.4 DIBAC4（3）熒光探針的配制 取DIBAC4（3）25μl（1mg／ml）加入Hepes液至10ml即成5 μM 液，避光冷藏備用。

1.5 OHC的分離及染色 在5個不同的時間點分別隨機活殺兩組中的2只豚鼠，于2分鐘內取出聽泡，浸于Hepes液中，在解剖顯微鏡下分離出第2～4回基底膜，用微量加樣器吸取分離出的基底膜于玻璃試管中，加入等量的0.5 mg／ml IV 膠原酶（Sigma，用Hepes液配制，終濃度為0.25mg／ml），輕輕吹打5次，靜置10分鐘后用Hepes液洗滌3次；微量加樣器加入5μM 的DIBAC4（3）避光染色20分鐘；離心去除上清液。吸取50μl細胞懸液加入含有薄層多聚賴氨酸的特制培養皿中（Sigma，用三蒸水配成0.25mg／μl，50μl加入培養皿中，無菌風干備用），靜置5分鐘。將培養皿置于ACAS 570載物臺上，顯微鏡下選取活性良好的OHC［2］進行檢測。

1.6 OHC膜電位的檢測 選取活性良好的OHC，在靜息狀態下先掃描40秒后，將純音測聽儀輸出耳機距培養皿約10cm 高，由上而下對準培養皿底部，采用2 000Hz純音，分別于掃描第40、70、100、140、170、200、225、240 及275s時予10、20、30、40、50、60、70、80及100dB HL純音刺激，每次持續3s，于100dB HL 時持續刺激60s，觀察OHC 內熒光值的改變。上述實驗于室溫下（20～25 ℃）1小時內完成，以確保OHC的良好活性。

1.7 統計學方法 實驗數據均采用SPSS13.0軟件包進行統計分析。豚鼠的離體單個OHC 首次聲刺激的去極化時間、首次去極化膜電位水平（熒光值）采用±s表示；對照組和輻射組之間的比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 靜息狀態下離體OHC熒光值特征 DIBAC4（3）為一種親陽離子的陰離子染料探針，其跨膜分布依賴于膜電位。在靜息狀態下OHC 呈現試管狀，DIBAC4（3）均勻、無規則分布于整個細胞質中，胞漿的兩極相對集中，周邊較弱（圖1、2）。

2.2 對照組OHC膜電位變化規律 對照組豚鼠的離體單個OHC 在2 000 Hz不同強度純音刺激下，細胞內熒光強度呈不同程度的增高（曲線上升），而刺激間歇時，細胞內熒光強度亦開始回落（曲線下降），伴隨聲刺激的持續和間斷，曲線亦呈現上升、下降、再上升和再下降之變化規律，即OHC 產生去極化、復極化、再去極化和再復極化改變。圖3提示：予2 000Hz、10dB HL 純音聲刺激OHC 時，第40 s細胞內熒光值開始升高，并于第50s達到峰值（1.112u），隨后細胞內熒光值開始回落，于第60s至最低值（1.000u）。表明對照組OHC 首次去極化時間為10s，并于10s內完成復極化。

2.3 輻射組OHC 膜電位變化規律 輻射組手機微波輻射后1 小時檢測結果表明，予2 000 Hz、10 dB HL純音刺激OHC時，第40s細胞內熒光值亦開始升高，第65s達到峰值（1.100u），隨后細胞內熒光值開始回落，至第二次聲刺激（第70s、20dB HL）開始時回落至1.045u。以后連續3次聲刺激時曲線有微上升，但都未能達到峰值和完全回落，提示手機微波輻射1小時后，OHC細胞膜的去極化和復極化時間明顯延長且不能完全去極化和復極化（圖4）。輻射6小時和12小時后，隨著間斷的聲刺激可見OHC內熒光值緩慢上升，輻射6 小時組之毛細胞于第70s熒光值達峰值（1.100u），而輻射12小時組之毛細胞于第90s熒光值達峰值（1.050 u），隨后整條曲線呈微上升趨勢（圖5、6）。輻射24和48小時后，經過聲刺激，曲線呈微上升、微下降波動，無明顯峰值及回落（圖7）。提示經手機微波連續輻射24小時后，OHC無明顯去極化和復極化過程。

2.4 首次聲刺激OHC 膜電位熒光峰值變化規律 手機微波輻射1、6、12、24和48小時后，離體豚鼠OHC首次聲刺激后膜電位熒光峰值較對照組顯著降低（P＝0.000，P＜0.01）。輻射后1小時和6小時兩組相比較，OHC首次聲刺激后的膜電位熒光峰值水平差異無顯著統計學意義（P＝0.129，P＞0.05），且OHC膜電位熒光值水平均為1.00u（圖4，5）。隨輻射時間的延長，首次聲刺激后OHC 膜電位熒光峰值水平逐漸下降，輻射時間越長，下降越明顯。

2.5 首次聲刺激OHC 去極化時間變化規律 手機微波輻射1、6、12小時后，OHC 首次去極化時間較對照組顯著延長（P＝0.000，P＜0.01）；隨著輻射時間的延長，OHC去極化時間明顯延長，輻射12小時后，去極化時間最長；輻射后各組與對照組比較差異均有顯著統計學意義（P＝0.000，P＜0.01）；輻射24和48小時后，膜電位僅呈輕微、不規律的波動，沒有明顯的去極化過程（表1）。

表1 首次聲刺激后各組OHC膜電位熒光峰值和去極化時間（膜電位水平）（±s）

表1 首次聲刺激后各組OHC膜電位熒光峰值和去極化時間（膜電位水平）（±s）

組別膜電位的熒光值（u）去極化時間（s）1.112±0.002 9.92±0.16輻射組 輻射1小時1.087±0.116 24.97±0.18 輻射6小時1.081±0.014 30.49±0.98 輻射12小時1.046±0.003 50.00±1.27 輻射24小時1.021±0.007— 輻射48小時1.021±0.007對照組—

圖1 靜息狀態下對照組離體OHC形態及DIBAC4（3）熒光分布圖2 靜息狀態下輻射組輻射1h離體OHC形態及DIBAC4（3）熒光分布圖3 2 000Hz聲刺激后對照組OHC熒光值變化曲線

圖4 2 000Hz聲刺激后輻射1h組OHC熒光值變化曲線圖5 2 000Hz聲刺激后輻射6h組OHC熒光值變化曲線圖6 2 000Hz聲刺激后輻射12h組OHC熒光值變化曲線圖7 2 000Hz聲刺激后輻射24、48h組OHC熒光值變化曲線

3 討論

手機電磁輻射屬于微波波段，頻率為800～2 000 MHz。手機微波輻射能量以脈沖式重復遞增，其頻率高、波長短，對生物體的影響較大。目前使用最為普遍的手機是采用全球定位系統的數字手機，中心頻率為900 MHz，通過微波的微小調制來傳輸語音信息。有研究者［2］發現，電磁輻射對人體的作用主要是非熱效應，并指出這與神經系統方面的異常表現有關，電磁輻射對兒童的免疫功能和神經系統影響更為突出。Monfrecola等［3］用手機輻射志愿者的耳部，然后測定皮膚的血流量，發現手機輻射組的血流量較對照組顯著升高。Moustafa等［4］試驗表明暴露于手機輻射場中1、2、4小時后，血漿中油脂過氧化物水平顯著增高，自由基清除劑超氧化物歧化酶活性顯著降低。有實驗室采用大白鼠模型來研究手機輻射的促癌作用，結論認為長時間、高頻率使用移動電話能提高誘發腦部惡性腫瘤的風險，并且顳葉的腫瘤尤為明顯，其中又以聽神經瘤的患病風險最高［5］。使用手機時通常是靠近或緊貼耳部，因此聽覺系統被認為是最有可能受到影響的器官之一［6］。

耳蝸OHC的運動可增強基底膜振諧曲線對特征頻率的敏銳度，對內毛細胞有驅動效應作用，并間接影響內毛細胞對振動刺激信號的敏感性。這表明OHC及其膜電位在人類聽覺生理中具有重要作用，其生理功能狀態對聽覺功能有直接的影響。當耳蝸受到聲刺激時，在耳蝸及其附近結構可記錄到一種特殊的電波動，通常稱之為微音電位［7］，這是一種由聲刺激誘發的、起源于許多OHC 且存在于細胞外的感受器交流總和電位，耳蝸微音電位主要來源是OHC（占80%～85%），而小部分來源于IHC（15%～20%）［8］。電阻調制學說認為毛細胞頂部的膜內、外存在著約140mV 的巨大電位差，OHC 膜可能起著一個可變電阻器的作用，其阻值隨著聽纖毛向不同方向的彎曲和復位而增大或減少，造成膜電阻的相應波動，在膜兩側形成一個波動式的電壓變化，對原有的毛細胞靜息電位（－60 mV）和內淋巴電位（＋80mV）進行調制。當耳蝸毛細胞受到機械刺激興奮后，產生耳蝸微音電位，傳入神經的谷氨酸遞質釋放激活鈣離子通道，引起蝸神經末梢興奮產生動作電位，上傳至大腦皮層產生聽覺［8］。OHC膜電位的大小及變化決定了微音電位的大小及變化規律［9］。本研究中OHC膜電位改變的機理可能是微波輻射引起OHC 的鈣通道激活，使得鈣離子通透性增加并通過OHC 的胞膜內流，使鈉－鈣交換受到抑制，胞內鈣離子的增加改變了OHC 的膜電位和能動性。

耳蝸的聽覺過程是一個從機械刺激到發放神經沖動的環節，耳蝸向聽覺中樞提供精確的聽覺信息，使中樞對聽覺信息進行精細處理并對聽敏度起著關鍵的作用。本實驗采用ACAS 570粘附細胞儀、DIBAC4（3）熒光探針為檢測手段，以2 000Hz不同強度純音刺激作用于離體狀態下活OHC，動態觀察OHC膜電位的變化規律。ACAS 570 為粘附式細胞分析及篩選激光顯微鏡，具有高分辨率，可用于活細胞的功能研究，如細胞內染色體、pH 值、離子濃度和膜電位測定等。DiBAC4（3）是一種膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，該染料于去極化時進入細胞，細胞內熒光強度增加；復極化時從細胞內移出，細胞內熒光強度降低。根據其在細胞內、外的重新分布，可判斷出細胞膜電位的變化［10］。本實驗中DiBAC4（3）熒光值與膜電位的對應關系為：第40s予2 000Hz、10dB HL 純音刺激OHC 時，細胞內熒光值開始升高，第50s達到峰值（1.112u），刺激間歇期細胞內熒光值開始回落，第60s至最低值（1.000u），即OHC完全去極化時之膜電位所對應的熒光值為1.112u，而完全復極化時膜電位所對應的熒光值為1.000u。本實驗結果提示：當予2 000Hz不同強度純音聲刺激對照組OHC 時，OHC產生規律性的去極化、復極化、再去極化和再復極化改變；手機微波輻射1小時后，OHC 細胞膜的去極化和復極化時間明顯增加，并且不能完全去極化和復極化；輻射時間超過6小時后，伴隨聲刺激曲線呈微上升、微下降波動，無明顯峰值及回落。提示手機微波連續輻射6小時后，OHC無明顯去極化和復極化過程，去極化的峰值明顯降低，動作電位產生的峰值也降低；當輻射時間大于24h時，聲刺激后OHC基本不能出現膜電位變化。產生此結果的原因可能是由于手機微波輻射改變了OHC 膜表面的跨膜蛋白結構，并進而影響OHC 膜離子通透性及跨膜電位的形成［11］。

綜上所述：長時間的手機微波輻射能引起離體豚鼠耳蝸OHC膜離子通透性的改變，影響OHC膜電位的形成及細胞去極化、復極化，從而導致離體OHC膜電位對不同強度純音刺激的敏感性逐漸降低。至于手機微波輻射如何改變以及改變何種離子通透性，則有待進一步實驗研究。本實驗不足之處是，2 000Hz不同強度純音刺激由空氣介質進入水溶液介質時，將產生一定的折射損耗，作用于OHC的刺激強度有所減弱。因此，應進一步改進實驗方法和手段，以獲得更加接近于生理狀態下的實驗結果。

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