補佳樂聯合縮宮素建立小鼠原發性痛經模型

陳景偉，仝瑞曉，孫曉換，范麗潔，杜惠蘭

(1.河北醫科大學，石家莊 050091;2.河北中醫學院，石家莊 050091)

原發性痛經是婦科常見病、多發病，嚴重者可影響患者生活質量，因此備受關注。由于人體研究的限制性，建立動物痛經模型對研究痛經的發病機制和防治具有重要意義。目前原發性痛經動物模型多采取雌激素聯合縮宮素誘發扭體反應，常用雌激素為已烯雌酚和苯甲酸雌二醇，由于藥物利潤低及副作用大等原因，這兩種藥物臨床已經很少應用;縮宮素多為腹腔注射，但應用劑量報道不一，目前有每只2 U［1］、2 U/kg［2］、20 U/kg［3］，有必要摸索最佳劑量。據報道相同方法建立的痛經模型，小鼠扭體次數約為大鼠的6 倍［4］，因此本研究采用目前臨床廣泛應用的補佳樂聯合縮宮素誘發扭體反應，不同條件下，組間比較，篩選最佳條件，建立近交系小鼠痛經模型，為原發性痛經的研究建立一種理想、實用的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級近交系BALB/c 雌性小鼠82 只，6 ～8 周齡，性周期4 ～5 d，體重(18 ±2)g，購自河北省實驗動物中心［SCXK(冀)2008-1003］，室溫20 ～23℃，相對濕度:45% ～60%，12 h 光照/黑暗交替飼養。自由獲取食物和水，實驗于河北醫科大學中醫學院中藥藥理實驗室進行［SYXK(冀)2011-0047］。

1.2 實驗器械及藥品

補佳樂(戊酸雌二醇片)，規格:每片1 mg，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司產品，批號:222A;縮宮素注射液，規格:10 U/mL，上海禾豐制藥有限公司產品，批號120509;0.9% 生理鹽水，規格:每瓶500 mL，石家莊四藥有限公司，批號120731608;蒸餾水(自制)。

1.3 補佳樂混懸液配制

補佳樂低劑量組(0.5 mg/kg):1 mg 補佳樂片研碎，溶于40 mL 蒸餾水中，配成濃度為1∶40 的混懸液作為補佳樂低劑量備用;補佳樂高劑量組(1 mg/kg):1 mg 補佳樂片研碎溶于20 mL 蒸餾水中，配成濃度為1∶20 的混懸液作為補佳樂高劑量備用。

1.4 不同濃度縮宮素配制

用10 U/mL 的縮宮素，稀釋10 倍制成濃度為1 U/mL 的縮宮素備用;稀釋2 倍制成濃度為5 U/mL的縮宮素備用;及10 U/mL 縮宮素備用。

1.5 補佳樂劑量的篩選

20 只雌性近交系BALB/c 小鼠隨機分為2 組，分別灌胃不同劑量補佳樂，低劑量組(0.5 mg/kg)，每只小鼠灌胃容量為體重(kg)×20 mL(相當于人臨床用藥量的10 倍);高劑量組(1 mg/kg)，每只小鼠灌胃容量為體重(kg)×10 mL(相當于人臨床用藥量的20 倍)，連續12 d，于末次給藥后1 h，分別腹腔注射縮宮素2 U/只，觀察扭體反應并記錄扭體反應潛伏期及扭體次數。篩選補佳樂給藥最佳劑量。

1.6 補佳樂用藥周期的篩選

12 只雌性近交系BALB/c 小鼠，每天灌胃補佳樂0.5 mg/kg，連續15 d，并于每天給藥后1 h，腹腔注射縮宮素每只2 U，記錄30 min 內扭體潛伏期及扭體次數。篩選最佳給藥周期。

1.7 縮宮素劑量的篩選

30 只雌性近交系BALB/c 小鼠隨機分為3 組，每組連續灌胃補佳樂0.5 mg/kg 共12 d 后，于末次給藥后1 h 腹腔注射不同濃度縮宮素。每只0.4 U組腹腔注射1 U/ mL 縮宮素0.4 mL，每只1 U 組腹腔注射5 U/mL 縮宮素0.2 mL，每只2 U 組腹腔注射10 U/mL 縮宮素0.2 mL，篩選縮宮素最佳劑量。

1.8 腹腔注射縮宮素時間的篩選

20 只雌性近交系BALB/c 小鼠隨機分為2 組，每組連續灌胃補佳樂0.5 mg/kg 共12 d 后，分別于末次給藥后0.5、1 h 腹腔注射縮宮素每只2 U 誘發扭體反應，并記錄30min 內的扭體潛伏期及扭體次數。篩選腹腔注射縮宮素的最佳時間。

1.9 統計學方法

采用SPSS 13.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差±s)表示，兩樣本比較用t檢驗，組間比較用單因素方差分析，以P ＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量補佳樂對扭體反應的影響

補佳樂0.5、1 mg/kg 連續灌胃12 d，并于末次給藥后1 h 誘發扭體反應，結果表明，0.5 mg/kg 組與1 mg/kg 組扭體潛伏期及扭體次數無統計學差異(均為P ＞0.05)，見表1。因此確定較小有效劑量0.5 mg/kg 為適宜劑量。

表1 不同劑量補佳樂對扭體次數和扭體潛伏期的影響Tab.1 Effect of different doses of progynova on writhning frequency and latency in the mice

2.2 補佳樂用藥周期對扭體反應的影響

補佳樂0.5 mg/kg，連續灌胃15 d ，每天觀察扭體反應，結果表明，第3 天時扭體次數開始增多;從第4 天開始維持在高水平。第14 天扭體次數最多，明顯多于第1、2、3 天，但于其他時間點無統計學差異。結合小鼠動情周期4 ～5 d，并且小鼠痛經模型的建立時間以10 ～15 d 為宜［4］，因此選擇補佳樂連續給藥三個動情周期即12 d 為給藥周期。見表2。

2.3 不同劑量縮宮素對扭體反應的影響

連續灌胃補佳樂12 d 后，腹腔注射縮宮素每只0.4、1、2 U，誘發扭體反應，統計結果表明，每只2 U發生的扭體次數明顯多于每只1、0.4 U，差異有統計學意義(均為P ＜0.01)。每只0.4、1 U 誘發的扭體次數相比無統計學差異(P ＞0.05)。每只2 U 扭體潛伏期明顯短于每只1、0.4 U，差異有統計學意義(均為P ＜0.01)，每只0.4、1 U 扭體潛伏期相比無統計學差異(P ＞0.05)。見表3。因此以縮宮素每只2 U 誘發扭體反應為最佳劑量。

表2 補佳樂用藥周期對扭體次數及扭體潛伏期的影響Tab.2 effect of progynova administration cycles on the writhing frequency and latency in the mice

表3 不同劑量縮宮素對扭體潛伏期和扭體次數的影響Tab.3 Effect of progynova at different doses on the writhing latency and frequency in the mice

2.4 不同時間腹腔注射縮宮素對扭體反應的影響

分別于末次給藥后0.5、1 h 腹腔注射縮宮素每只2 U，均能誘發扭體反應，統計結果表明于末次給藥后1 h 后腹腔注射縮宮素誘發的扭體次數明顯多于0.5 h 組(P ＜0.05)，潛伏期明顯短于0.5 h 組(P＜0.01)，差異有統計學意義。見表4。因此以末次給藥后1 h 腹腔注射縮宮素為最佳時間。

表4 不同時間腹腔注射縮宮素對扭體反應的影響Tab.4 effect of progenova injected at different time points on the writhing in the mice

3 討論

目前痛經在體動物模型多采用SD 大鼠［5-8］、Wistar 大 鼠［9-11］、KM 小 鼠［12-14］及ICR 小 鼠［15-16］。利用近交系小鼠建立痛經模型尚未見報道。近交系小鼠基因高度純化，且具有長期遺傳的穩定性和對實驗的敏感性和一致性，因此對藥物反應的結果比較一致，可以減少重復試驗的次數，節省實驗時間，故本實驗選用近交系小鼠。痛經模型的建立需要致敏和致痛兩個步驟［17］，補佳樂是天然雌激素類藥物，每片含天然雌激素戊酸雌二醇1 mg，可刺激子宮內膜生長［18］，并能提高子宮肌對縮宮素的敏感性［19］，目前臨床應用極為廣泛，因此，本研究采用補佳樂作為致敏藥物;致痛藥物常選用縮宮素及前列腺素，而縮宮素應用更為廣泛，并且縮宮素誘發的扭體次數明顯多于前列腺素PGF2a［4］?？s宮素可作用于子宮平滑肌引起子宮強烈而持續的收縮［5］，這種收縮與痛經引起的子宮強烈收縮相似，因此常被用于痛經模型的致痛藥物［15］。

本實驗采用補佳樂聯合縮宮素建立近交系小鼠原發性痛經模型，并對所需的最佳條件進行了摸索。結果表明補佳樂0.5 mg/kg 連續灌胃12 d，于末次給藥后1h 腹腔注射縮宮素每只2 U 為最佳方案，能快速誘發扭體反應，扭體反應80%集中在注射縮宮素后15 min 內，成功建立原發性痛經模型。實驗周期短，成功率高，所需藥品容易購得，為研究原發性痛經的發病機制及藥理作用的提供了理想模型。

［1］呂江明，李春艷，賈薇.三葉青水提物抑制小鼠痛經作用［J］.廣州醫藥，2011，42(4):39 －42.

［2］楊雅琴，黃光英.針刺對痛經小鼠止痛作用及其機制的研究［J］.中國針灸，2008，28(2):119 －121.

［3］李興嶺，佟力，佟欣.等.加味佛手散對縮宮素致小鼠痛經模型的影響［J］.中國中醫急癥，2011，20(4):601 －602.

［4］孫海燕，曹永孝，劉靜，等.小鼠痛經模型的建立［J］.中國藥理學通報，2002，18(2):233 －236.

［5］趙偉國，李運景，黃民.痛經康口服液對痛經大鼠子宮組織中催產素受體及加壓素受體mRNA 的表達的影響［J］.中成藥，2012，34(7):1224 －1228.

［6］李蘭芳，解麗君，李國風.等.復方消經痛膠囊對縮宮素誘發大鼠痛經模型的鎮痛作用［J］.中成藥，2009，31(3):363－367.

［7］郭孟瑋，丁喜艷，任曉暄.等.預先電針三陰交血海合谷對痛經大鼠模型子宮IP3 的影響［J］.遼寧中醫雜志，2010，37(10):2048 －2051.

［8］劉冬，譚秦莉，李玉寶.等.桃紅四物湯治療原發性痛經實驗研究［J］.安徽中醫學院學報，2009，28(2):46 －48.

［9］孫會娟，底建敏.經痛靈沖劑防治大鼠痛經的作用及機制研究［J］.河北醫藥，2009，31(16):2055 －2057.

［10］孔黎明，李霞.經痛安顆粒治療原發性痛經的實驗研究［J］.中醫臨床研究，2011，3(18):37 －40.

［11］李莉，孫聰，谷仿麗，等.桂枝茯苓軟膠囊治療痛經的實驗研究［J］.安徽中醫學院學報，2008，27(3):35 －38.

［12］葉其正，沈明勤，羅宇慧.等.痛經寶膠囊對實驗性痛經模型的鎮痛作用及其機理初探［J］.江蘇中醫藥，2009，41(6):67 －68.

［13］王團結，歐陽臻，宿樹蘭.等.沒藥不同提取物對小鼠痛經模型的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20(3):225－228.

［14］賀克，劉姣，李清.等.丹莪婦康煎膏對小鼠痛經模型的影響［J］.中藥藥理與臨床，2012，28(3):106 －108.

［15］曹亮，潘媛，鄧奕，等.散結鎮痛片對小鼠實驗性痛經模型的影響［J］.世界科學技術(中醫藥現代化)，2012，14(2):1493 －1497.

［16］王歡，唐于平，郭建明，等.當歸-川芎配伍對小鼠原發性痛經的影響［J］.中國中藥雜志，2010，35(7):892 －895.

［17］嵇波，張露芬，朱江，等.痛經模型建立和評價方法的思考［J］.中國藥理學通報，2008，24(6):711 －714.

［18］楊潔，侯棚鐘，黃曉虹.等.補佳樂聯合復方氨維膠囊對薄型子宮內膜不孕癥者妊娠結局的改善［J］.生殖與避孕，2012，32(6):413 －416.

［19］崔曉黎.補佳樂在稽留流產中的臨床應用［J］.河南外科學雜志，2012，18(5):99 －100.