眼鏡蛇毒因子抑制小鼠疼痛反應

劉巧洲，郭 靜，石 磊，李 嬌，楊慶雄，孫黔云

(1. 貴州師范大學化學與材料科學學院，貴州 貴陽 550001；2.貴州醫科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3. 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

疼痛是諸多病征共有的癥狀，是動物的神經系統對傷害刺激的感覺。疼痛研究的焦點在于疼痛發生的機制以及干預治療的策略和藥物研究[1-2]。補體旁路激活會導致炎癥和組織損傷[3]。有研究表明，補體與某些神經病理性疼痛關系密切[4-5]，但其與非神經性疼痛的關系尚不清楚。本研究用眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)特異抑制補體旁路途徑，觀察小鼠對疼痛的反應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑SPF級KM小鼠，♀，體質量18～22 g，中國人民解放軍第三軍醫大學動物實驗中心提供，合格證：SCXK(軍)2012-0011；普通新西蘭兔，♂，2.5 kg，重慶騰鑫生物技術公司提供，合格證：SCXK(渝)2017-0010。CVF由本實驗室制備，方法同文獻[6]；其他試劑均為符合實驗要求的國產或進口分析純。

1.2 儀器MD-190酶標儀(美國MD公司)；5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；YLS-6B智能熱板儀(山東省醫學科學院設備站)；超低溫冰箱(中科美菱科技股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1CVF抑制小鼠血清補體旁路途徑測定 小鼠尾靜脈注射0.05 μg·g-1CVF，毛細管眼眶采取給藥前和給藥后1、3、6、12、24、48、72、120 h的血液，制備血清，參照文獻[7]，測定并計算補體旁路溶血活性。

1.3.2熱板法 熱板儀55 ℃篩選合格小鼠32只，隨機均分為4組：0.05 μg·g-1CVF組和對照組、0.075 μg·g-1CVF組和對照組，對照組給予等體積生理鹽水。記錄小鼠給藥前和給藥后1、3、6、12、24、48 h的痛覺反應時間，計算痛閾提高百分率：痛閾提高百分率=(藥后痛覺反應時間-藥前痛覺反應時間)/藥前痛覺反應時間×100%。

1.3.3醋酸扭體法 32只小鼠隨機均分為4組：0.05 μg·g-1CVF組和對照組、0.075 μg·g-1CVF組和對照組，對照組給予等體積生理鹽水。在給藥后1、6、12、24、48 h，腹腔注射0.6%醋酸0.1 mL，記錄15 min內小鼠扭體次數，計算扭體反應抑制率：扭體反應抑制率=(對照組扭體次數-實驗組扭體次數)/對照組扭體次數×100%。

Tab 1 Time of pain response of mice after treated with different doses of

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs0 h

Tab 2 Twisting number of mice after treated with different doses of

**P<0.01vscontrol

2 結果

2.1 CVF抑制補體旁路途徑的作用靜脈注射CVF后，小鼠補體旁路溶血活性快速下降。給藥1 h時，補體活性降至(7.34±1.74)%，3、6 h時降至(5.89±2.28)%、(5.6±2.13)%，72 h時已回升至(34.85±7.78)%，120 h已基本恢復至(88.56±16.57)%。

2.2 CVF抑制小鼠熱疼痛反應的作用CVF能明顯抑制小鼠對熱疼痛的反應。與給藥前相比，0.05 μg·g-1CVF組在給藥后3 h的痛覺反應時間明顯延緩(P<0.05)；0.075 μg·g-1CVF組在給藥后1、3、6、12 h的痛覺反應時間均明顯延緩(P<0.01)。與對照組相比，0.05 μg·g-1CVF 組在給藥后3、6 h的痛閾百分率明顯提高(P<0.01)；0.075 μg·g-1CVF組在給藥后1、3、6、12 h的痛覺反應時間明顯延緩(P<0.01)，其痛閾百分率明顯提高(P<0.01)。見Tab 1。

2.3 CVF抑制小鼠醋酸扭體反應CVF能有效抑制醋酸造成的小鼠扭體反應。Tab 2結果顯示，與對照組比較，0.05、0.075 μg·g-1CVF組小鼠均在給藥后1、6 h的扭體次數明顯減少(P<0.01)；扭體抑制率在1 h時分別為(63.19±9.28)%、(64.65±17.83)%，6 h時分別為(61.11±19.43)%、(49.82±15.99)%，12 h時分別為(2.9±26.31)%、(20.86±39.43)%，24 h時分別為(18.66±55.92)%、(22.73±22.96)%，48 h時分別為(0.48±42.15)%、(12.12±14.7)%。

3 討論

本研究表明，尾靜脈注射CVF抑制小鼠體內補體旁路途徑后，能明顯減輕小鼠對熱疼痛和醋酸刺激的反應，且這種抑制作用表現出一定的量效關系；小鼠對疼痛的反應與CVF致小鼠血清中補體旁路的變化有較好的對應性。熱板法是一種篩選中樞性鎮痛藥的經典方法，醋酸扭體法適用于中樞和外周鎮痛藥的篩選。因此，上述結果提示，血清補體旁路與小鼠疼痛反應，尤其是中樞性疼痛可能有密切關聯，這為進一步研究補體與疼痛的關系及潛在的藥物靶點提供了參考。