丹參酮對兔急性心梗再灌注損傷的心肌保護

章慧慧，黃抒偉，王琳莉，林冬銘

(1.杭州市余杭區第一人民醫院，杭州 311100；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院心內科，杭州 310005)

丹參酮對兔急性心梗再灌注損傷的心肌保護

章慧慧1,2，黃抒偉2*，王琳莉2，林冬銘2

(1.杭州市余杭區第一人民醫院，杭州 311100；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院心內科，杭州 310005)

目的 探討丹參酮在心肌梗死再灌注損傷中的干預作用，為臨床治療提供實驗依據。方法 將40只，♂，新西蘭大白兔按成組設計應用隨機列表法分成4組，每組10只：葡萄糖再灌注組、丹參酮再灌注治療組、丹參酮冠脈結扎前治療組和假手術組。建立再灌注模型后經耳緣靜脈給藥。分別于結扎前5 min、結扎后1 h、再灌注后2 h時，取血清檢測肌酸激酶(CK)、肌酸激酶的同功酶(CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)。并于再灌注后2 h，以1%的四氮唑紅溶液制作心肌切片，以AutoCAD 2002圖形設計軟件計算壞死心肌范圍。結果 ①丹參酮再灌注組與葡萄糖再灌注組、丹參酮結扎前治療組與葡萄糖再灌注組在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ有統計學差異(P＜0.05)；丹參酮再灌注組與丹參酮結扎前治療組在再灌注后2 h的CK、CK-MB無統計學差異(P＞0.05)、Tn-Ⅰ有統計學差異(P＜0.05)。②丹參酮再灌注組與葡萄糖再灌注組、丹參酮結扎前治療組與葡萄糖再灌注組心肌梗死范圍比較有統計學差異(P＜0.05)。丹參酮再灌注組與丹參酮結扎前治療組無統計學差異(P＞0.05)。結論 靜脈注射丹參酮可以降低兔急性心肌梗死再灌注后CK、CK-MB、Tn-Ⅰ，并減少兔急性心肌梗死面積。

丹參酮；心肌缺血再灌注損傷；心肌保護

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury)是指在心肌缺血一段時間后，再次恢復血供后發生的更為嚴重的損傷，可以導致缺血面積擴大、無復流(no-reflow phenomenon，NR)、心肌頓抑和再灌注心律失常等。目前，心肌缺血再灌注損傷越來越受到人們重視，對于心肌缺血再灌注損傷的發生機制還沒有完全清楚。丹參酮作為我國的傳統中藥，在治療心腦血管病方面有著很好的效果，已有多項研究顯示丹參酮具有抗炎、抗血小板、抗血栓形成、緩解心絞痛以及抗腫瘤作用。本實驗以新西蘭大白兔為實驗對象，通過結扎冠脈建立急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)再灌注模型，評價AMI再灌注后心肌梗死面積以及血液學指標的變化，探討丹參酮對缺血再灌注損傷的保護作用及其作用機制，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康新西蘭大白兔40只，♂，體質量2.5～3.0 kg，浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(浙)2008-0036。

1.1.2 藥品 丹參酮針劑(上海第一生化藥業有限公司，規格：2 mL︰10 mg，批號：100722)；葡萄糖注射液(杭州民生藥業有限責任公司，批號：21011121)。

1.1.3 生化試劑與檢測儀器 磷酸肌酸激酶(CK) (生產商：廣州標佳，批號：103111)；肌酸激酶的同功酶(CK-MB)(生產商：英國朗道公司，批號：CK1553)；肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)(生產商：美國BioMerieux，批號：1000498140)。

檢測儀器：UniCel DxC800全自動生化分析儀(BECKMAN公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分組 將40只新西蘭大白兔，♂，按成組設計應用隨機列表法分成4組，每組10只。以3%戊巴比妥鈉1.1 mL·kg-1經耳緣靜脈注射麻醉，沿胸骨正中開胸，保持胸膜完整，將結扎線圈內置入硅膠管結扎左室緣支1 h，以心電圖出現ST段弓背向上抬高2 mm為結扎有效，再松解2 h建立AMI及再灌注模型，假手術組只繞冠狀動脈左室緣支穿線，不結扎。4組分別經耳緣靜脈給藥：葡萄糖再灌注組為對照組，再灌注前10 min緩慢注射25%的葡萄糖注射液2 mL·kg-1；丹參酮再灌注治療組，再灌注前10 min耳緣靜脈緩慢注射丹參酮ⅡA磺酸鈉5.0 mg·kg-1溶于25%葡萄糖注射液1 mL·kg-1中；丹參酮冠脈結扎前治療組，結扎前30 min耳緣靜脈緩慢注射丹參酮ⅡA磺酸鈉，劑量同丹參酮再灌注治療組；假手術組，再灌注前10 min由耳緣靜脈緩慢注射25%的葡萄糖注射液2 mL·kg-1。

1.2.2 血清樣本制備方法 分別于結扎前5 min、結扎后1 h、再灌注后2 h，從頸總動脈取血4 mL，放入低溫離心機中，3 500 r·min-1離心，10 min后取血清，-70 ℃保存。

1.2.3 生化指標檢測方法 取制備好的血清樣本，使用UniCel DxC800全自動生化分析儀(BECKMAN公司)對CK、CK-MB 以及Tn-Ⅰ濃度進行測定。

1.2.4 心肌梗死范圍的測定 再灌注120 min后，立即取出心臟，沿心臟長軸分為5～6心肌短軸切片，再將整個心肌切片放入1%的四氮唑紅(triphen yltetrazoliumchloride，TTC)溶液(pH 7.4)中，37 ℃孵箱中孵化15 min，梗死心肌不著色，非梗死部位心肌呈磚紅色，對切片進行拍照。將錄像中各個斷面圖像輸入計算機，以Image-Pro Plus 6.0 圖象處理軟件計算各斷面左心室室壁心肌面積(left ventricular myocardial area，LVMA)、梗死區心肌面積(myocardial infraction area，MIA)，以MIA與LVMA之比作為壞死心肌范圍(MIA/LVMA/%)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各檢測點組間血清學指標比較

與葡萄糖再灌注組比較，丹參酮再灌注組和丹參酮結扎前治療組在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ顯著減小，存在統計學差異(P＜0.05)。假手術組與其他3組比較，在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ均有統計學差異(P＜0.05)。結果見表1。

表1 各組兔CK、CK-MB、Tn-Ⅰ測定結果(n=10)Tab 1 The results of CK, CK-MB, Tn-Ⅰ(n=10)

2.2 冠脈結扎組間新西蘭大白兔心肌梗死范圍比較

與葡萄糖再灌注組比較，丹參酮再灌注組和丹參酮冠脈結扎前治療組的心肌梗死范圍明顯減小(P＜0.05)，丹參酮再灌注組與丹參酮結扎前治療組無統計學差異(P＞0.05)。結果見表2和圖1。

表2 3組冠脈結扎組心肌梗死范圍(n=10)Tab 2 The area of myocardial infarction(n=10)

圖1 各組心肌梗死面積(不著色為梗死區域)A-葡萄糖再灌注組；B-丹參酮再灌注組；C-丹參酮結扎前治療組；D-假手術組Fig 1 The area of myocardial infarction(no coloring)A-glucose reperfusion group; B-tanshinone reperfusion group;C-tanshinone pre-blocking treatment group; D-sham-operation group

3 討論

3.1 心肌缺血再灌注損傷的發生機制

心肌缺血再灌注損傷是一種復雜的病理過程，其概念是在1960年由Jennings首先提出。心肌細胞發生缺血后，如果時間短，心肌尚處于可逆損傷的狀態，隨著時間的延長，心肌細胞的損傷呈進行性加重，當血供恢復后，缺血組織功能未能恢復甚至惡化，Moens等[1]認為心肌缺血再灌注損傷的主要機制可能是氧自由基生成、鈣超載和白細胞激活。其再灌注后發生的損傷不僅包括組織器官的代謝紊亂、功能障礙，也包括組織結構的破壞。其臨床后果有：①再灌性心肌頓抑(myocardial stunning)，即指心肌缺血再灌注后，心肌的力學功能需經一定時間，有時數天甚至數周后才能恢復；②再灌注性心律失常(reperfusion arrhythemia)，主要為室性期前收縮或室性心動過速；③心肌酶及鈣蛋白亞單位漏出，心肌酶包括CK、乳酸脫氫酶以及心肌特有的CK同工酶，通過測定血清中這些酶升高的程度可反映心肌損害的程度。Tn-Ⅰ是心肌特有的抗原，對心肌損傷具有高度的特異性和敏感性，是反映IRI的敏感指標。

3.2 丹參酮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用

丹參酮(tanshinone)是中藥丹參根的乙醚或乙醇提取物，其含有的醌類成分參與生物體內多種生化效應，在體內可表現出多種生物活性。其對缺血再灌注損傷的心肌保護作用可能通過以下機制實現。

3.2.1 清除氧自由基，減少心肌細胞的損傷 已有實驗證明[2]心肌缺血時心肌氧自由基大量產生，清除氧自由基的酶SOD活性下降，導致氧自由基在體內堆積，破壞了細胞膜的結構和功能，造成了心肌細胞損害。本實驗中使用丹參酮治療心肌梗死大白兔，結果表明心肌酶的溢出明顯減少，可能與提高心肌組織缺血后SOD的活力，增強內源性氧自由基清除，減輕了缺血再灌注區組織細胞的損傷有關[3]，具體的作用機制還需進一步的實驗證明。

3.2.2 鈣通道阻滯作用，抑制細胞內鈣超載 細胞內鈣離子超載是心肌細胞損傷和不可逆壞死的共同通路，故降低細胞內鈣離子濃度是防止或者減少心肌損傷的重要手段。孫學剛等[4]通過觀察發現丹參酮可引起心肌細胞出現超級化轉變，使細胞外鈣內流減少，通過防止心肌細胞內鈣超載而減輕心肌缺血后發生的再灌注損傷。研究還顯示丹參酮能減少缺氧引起的線粒體鈣內流，減少缺血再灌注損傷過程中，鈣超載導致的ATP酶激活引起的ATP耗竭，從而保護線粒體。丹參酮是否通過鈣通道阻滯作用使心肌細胞膜電位維持在正常水平，從而具有保護心肌的作用，值得做進一步的研究。

3.2.3 擴張冠狀動脈側枝血管，改善微循環，縮小心肌梗死面積 目前，多數人認為微循環障礙是心肌缺血再灌注損傷的重要機制，主要原因可能為毛細血管內皮的破壞以及微血栓或小動脈血栓形成。裴非等[5]通過大鼠實驗發現，復方丹參滴丸能使原缺血部位心肌毛細血管墨汁灌流數明顯增加，有效改善IR冠脈微循環缺血部位的血液灌流，縮小無復流面積。劉啟功等[6]實驗證實丹參注射液能促進冠脈側枝循環的開放和形成，并認為前者可能與其冠脈擴張作用有關，后者可能與丹參能使心肌血管內皮生長因子(VEGF)表達上調有關。張潔等[7]發現丹參酮對原代培養豬冠脈平滑肌上ATP敏感的鉀通道和鈣激活鉀通道均有直接激活作用，并由此推測可能由于上述通道的開放協同鈣通道阻滯作用可引起冠脈舒張，改善冠脈平滑肌的功能狀態。本實驗的研究顯示使用丹參酮治療后，與對照組大白兔的心肌梗死面積有統計學差異，支持這種推測，其具體機制有待更多深入的研究。

REFERENCES

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Myocardium Protection of Tanshinone on Ischemia Reperfusion Injury of Rabbits with Acute Myocardial Infarction

ZHANG Huihui1,2, HUANG Shuwei2*, WANG Linli2, LIN Dongming2
(1.First People’s Hospital of Yuhang District, Hangzhou 311100, China; 2.Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Traditional Chinese Medicine University, Hangzhou 310005, China)

OBJECTIVE To explore the effect of tanshinone on ischemia reperfusion injury of rabbits after acute myocardial infarction, and to supply the experimental proof for the clinic. METHODS Divide 40 male rabbits into 4 groups, 10 per group: glucose reperfusion group, tanshinone reperfusion group, tanshinone pre-blocking treatment group and sham-operation group. Reperfusion injury model was established and the drug was administrated intravenously. Blood was collected to test the CK, CK-MB, Tn-Ⅰ at the time of 5 min pre-blocking, 1 h post-blocking and 2 h post reperfusion. 1% Triphenyltetrazolium chloride was used to produce myocardial incision. AutoCAD 2002 software was applied to calculate the area of myocardial infarction. RESULTS ①Tanshinon e reperfusion group and glucose reperfusion group had significant differences in CK, CK-MB, Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). Tanshinone pre-blocking treatment group and glucose reperfusion group had significant differences in CK, CK-MB, Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). Tanshinone reperfusion group and tanshinone pre-blocking treatment group had no significant differences in CK, CK-MB after 2 h reperfusion(P＞0.05), and had significant differences in Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). ②The area of myoc ardial infarction between tanshinone reperfusion group and glucose reperfusion group, tanshinone pre-blocking treatment group and glucose reperfusion group had significant differences(P＜0.05). The area of myocardial infarction between tanshinone reperfusion group and tanshinone pre-blocking treatment group had no significant differences(P＞0.05). CONCLUSION Tanshinone can lower CK, CK-MB, Tn-Ⅰ of rabbits with acute myocardial infarction, and can decrease the area of myocardial infarction.

tanshinone; ischemia reperfusion injury; myocardium protection

R285.5

A

1007-7693(2013)10-1062-05

2013-03-29

浙江省中醫藥科技計劃項目(2009CA038)

章慧慧，女，碩士 Tel: 15905712748 E-mail: zhhzju@163.com*

黃抒偉，男，碩士，主任醫師，碩導 Tel: 13957121104 E-mail: shuwei@hotmail.com