富氫U W液減輕大鼠腎臟低溫保存期缺血損傷

徐如彬，杜洪印，喻文立，翁亦齊，王永旺，任恒昌

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市第一中心醫院麻醉科，天津300192）

腎移植是終末期腎病患者的最佳治療措施。由于需進行組織配型及供體轉運，供腎切取后常需低溫保存于器官保存液中，以減緩器官代謝，保存組織活性。然而，低溫、缺血、缺氧致使保存期移植器官組織缺氧及微循環障礙，腎小管上皮細胞損傷甚至死亡[1-2]。長時間冷缺血是移植腎功能延遲的主要風險因素之一，嚴重者導致慢性移植物腎病，移植腎失功能[3-4]。最近研究證實，即使在移植器官再灌注前，低溫保存所致的器官損傷也有活性氧簇（ROS）的參與[2，5-6]。另有文獻顯示，在低溫所致的細胞毒性級聯反應中，活性氧產生致使下游信號通路激活，導致細胞凋亡[1，7]。因此，在移植器官低溫保存期采取抗氧化措施，可減弱缺血損傷。分子氫（H2）是一種新型有效的抗氧化劑，可選擇性地清除細胞毒性氧自由基[8]。圍術期吸入H2或者應用含氫液體具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡作用，可顯著減輕移植所致的移植器官損傷[9-13]。最近一些研究將H2加入器官保存液中，發現在低溫保存期應用H2，可減輕移植所致缺血再灌注損傷，改善移植器官預后[11-13]。然而，應用含氫器官保存液能否減輕低溫保存期相關損傷尚未明確。本研究將 H2加入 University of Wisconsin器官保存液（UW液），制成富氫UW（HRUW）液，驗證其是否對低溫保存大鼠腎臟具有保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年雄性Wistar大鼠，體質量200～250g，購于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，無特殊病原體（SPF）環境下飼養，自由進食、飲水。

1.1.2 主要儀器 光學顯微鏡（日本Olympus公司，BX51TF）；分光光度計（美國Thermo Electron公司，UNICAM UV300）；氫氣發生器（北京中科匯恒技術開發有限公司，ZK-300）；氣相色譜分析儀（美國Agilent公司，6890N GC）。

1.1.3 主要試劑 UW 液（美國 Bristol-Myers Squibb公司）；脂質氧化（MDA）檢測試劑盒、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；Caspase-3活性檢測試劑盒（美國BioVision公司，K106）。

1.1.4 HRUW液制備 按Buchholz等[11]的方法，將氫氣沖入200mL UW液中，持續30min，制備HRUW液，γ射線殺菌，實驗時使用新鮮制備的HRUW液且每6h更換一次以保證穩定的氫濃度。1.2研究方法

1.2.1 動物模型制備 參照Mitchell等[14]的方法進行，腹腔注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉大鼠，腹正中切口暴露左側腎臟，顯微血管鉗阻斷下腔靜脈及腹主動脈上、下端，由腹主動脈下端插入灌注管。在下腔靜脈下端剪一開口，灌注UW液，速度1.5～2.0mL/min，左腎和所屬血管完全蒼白，且自下腔靜脈流出液變清澈時停止灌注，摘取左腎。腎臟低溫保存后，經中部橫切分為上下兩部分，上半部浸于4%中性甲醛溶液中過夜，石蠟包埋，用于組織形態學觀察。下半部迅速置于液氮中保存，用于提取蛋白檢測。

1.2.2 實驗分組 采用隨機數字表法將24只大鼠隨機分為3組，每組8只。正常對照組（C組）：腎臟不進行保存；UW液保存組（UW組）：將腎臟于4℃UW液中保存48h；HRUW液保存組（HRUW組）：將腎臟于4℃HRUW液中保存48h。

1.2.3 腎臟組織的形態學觀察 腎組織樣本保存于4%中性甲醛溶液內，石蠟包埋，制成5μm薄片，行HE染色，于光學顯微鏡下觀察，依照Gobe的評分方法[15]分析腎小管上皮細胞的損傷程度。

1.2.4 腎臟組織內丙二醛含量、Mn-SOD活性、Caspase-3活性的檢測 分別采用MDA檢測試劑盒、Mn-SOD活性檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒，按說明書進行操作。

2 結果

圖1 低溫保存后大鼠腎臟標本的組織形態學改變（HE×400） Fig 1 Hypothermic storage-induced morphological renal changes（HE×400）

2.1 腎臟組織形態學變化 各組大鼠腎臟組織形態學變化見圖1。C組腎臟腎小管結構清晰，無明顯病變；UW組可見腎小管損傷嚴重，小管明顯擴張，刷狀緣損傷嚴重甚至缺失，小管細胞內出現明顯空泡，細胞核深染，出現較多凋亡細胞；HRUW組病理改變較UW組明顯減輕，部分腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，凋亡細胞較UW組明顯減少。各組腎小管損傷的半定量評分結果見圖2。UW組腎小管損傷評分明顯高于C組（P<0.01），HRUW組腎小管損傷評分明顯低于UW組（P<0.05）。

圖2 HRUW液對腎小管損傷評分的影響Fig 2 The effects of HRUW solution on tubular injury scores

2.2 腎臟組織內MDA含量 UW組及HRUW組腎臟組織內MDA含量均高于C組（P<0.01）；HRUW組腎臟組織內MDA含量低于UW組（P< 0.01），見圖3。

圖3 HRUW液對腎組織內MDA含量的影響Fig 3 The effects of HRUW solution on MDA levels in renal tissue

2.3 各組腎臟組織內Mn-SOD活性變化 與C組相比，UW組和HRUW組腎臟組織內Mn-SOD活性均顯著降低（P<0.01）；HRUW組腎臟組織內Mn-SOD活性明顯高于UW組（P<0.01）。見圖4。

圖4 HRUW液對腎組織內Mn-SOD活性的影響Fig 4 The effects of HRUW solution on renal Mn-SOD activity

2.4 各組腎臟組織內Caspase-3活性變化 與C組相比，UW組和HRUW組腎臟組織內Caspase-3活性均顯著增高（P<0.01）；HRUW組腎臟組織內Caspase-3活性明顯低于UW組（P<0.01）。見圖5。

圖5 HRUW液對腎組織內Caspase-3活性的影響Fig 5 The effects of HRUW solution on renal Caspase-3activity

3 討論

本研究將H2充入UW液中用于大鼠腎臟低溫保存階段，首次證明富氫UW液減輕低溫保存期離體大鼠腎臟冷缺血損傷。

尸體供體器官常需經歷一段低溫保存時期。然而，低溫、缺血、缺氧常導致低溫保存器官產生嚴重的冷缺血損傷。嚴重的冷缺血損傷增加移植后器官功能恢復延遲的發生率，影響移植器官的長期預后。最近的文獻顯示，低溫保存器官產生ROS，激活下游信號通路，導致細胞凋亡，低溫保存器官產生冷缺血損傷[1，7]。H2是一種新型有效的抗氧化劑，可選擇性地清除細胞毒性氧自由基，具有抗氧化應激、抗炎癥、抗凋亡作用[8]。

移植器官在低溫保存階段產生ROS，與膜多不飽和脂肪酸穩定結合，導致脂質過氧化，擾亂膜流動性，破壞細胞結構，致使組織損傷。MDA是脂質過氧化反應的終產物，其含量反映脂質過氧化反應的程度及水平[16]。Mn-SOD是一種存在于線粒體內的核編碼蛋白酶，可將超氧化物歧化為過氧化氫，后者通過過氧化物酶或谷胱甘肽過氧化物酶分解為水。Mn-SOD是線粒體內的主要抗氧化劑，代表組織清除ROS的能力[17]。本研究結果顯示，離體腎臟在UW液中長時間低溫保存后，組織內MDA含量顯著升高，而HRUW液組腎臟組織MDA含量較UW液組明顯降低，同時Mn-SOD活性增強，也即消耗減少，表明將H2加入器官保存液中可清除低溫保存器官產生的ROS，產生抗氧化應激作用，從而減輕移植器官低溫保存損傷。

凋亡是低溫保存器官細胞死亡的一種重要形式，Caspase-3的激活被認為是凋亡過程的關鍵步驟，它的抑制可以阻止細胞凋亡[18]。既往研究顯示，在器官保存液中加入抗氧化劑或Caspase抑制劑可以抑制保存器官的細胞凋亡，減輕組織損傷[15，19]。本研究中，UW組腎組織形態學損傷嚴重，腎小管損傷評分顯著升高，凋亡細胞增加，同時腎組織Caspase-3活性明顯升高，表明移植器官長時間低溫保存致使腎組織細胞凋亡，產生低溫保存缺血損傷，這與此前的一些研究結果一致[1-2，8，19]。HRUW組腎組織形態學改變較UW組明顯改善，同時腎組織Caspase-3活性降低，表明往器官保存液中充入H2可以抑制低溫保存器官細胞凋亡。低溫保存期和再灌注期是移植器官遭受損傷的兩個重要階段。既往有研究顯示富氫器官保存液可減輕器官移植所致的缺血再灌注損傷，抑制移植后細胞凋亡，改善移植器官長期預后[11-13]。本研究結果表明，即使僅在再灌注期前的器官低溫保存階段，使用抗氧化劑H2也可抑制保存器官的細胞凋亡，減輕移植器官的低溫保存損傷。

H2作為抗氧化劑已經用于大量動物實驗研究，它可以迅速透過生物膜性結構，彌散到胞質、線粒體、細胞核產生作用[20]。富氫UW液制備方便，使用安全。最近已有用于制備臨床用富氫液體的設備上市[13]，富氫UW液將為臨床上改善移植器官低溫保存條件提供一種選擇。

綜上所述，將H2加入UW液用于大鼠離體腎臟低溫保存階段，可降低低溫缺血所致的氧化應激作用，抑制細胞凋亡，減輕大鼠腎臟低溫保存期損傷。

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