依達拉奉對吸入性肺損傷大鼠肺保護作用的實驗研究

肖長栓，劉 群，張建明，馮世海，趙永健，施 耘，劉婭平

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市第四醫院燒傷科，天津300222）

吸入性損傷是呼吸道和肺組織的共同損傷。由于其發病隱匿，病情危重，同時具有熱力和化學物質損害的特點，所以其治療仍然是一個難點。吸入性損傷后，系統性炎癥反應綜合征（SIRS）及缺氧中毒等因素可導致其他臟器繼發性損傷，最終導致多器官功能障礙綜合征（MODF）發生。依達拉奉是一種強效的新型氧自由基清除劑，化學名為3-甲基-l-苯基-2-吡唑啉-5酮，研究表明，其可以清除氧自由基，在高氧肺損傷和順鉑所致的腎臟損傷中有一定效果[1-2]。但對吸入性損傷的具體治療效果尚不清楚。本實驗通過依達拉奉對煙霧吸入性損傷大鼠模型不同作用時間來研究其對自由基及炎癥介質的影響，探索其對煙霧吸入性肺損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 依達拉奉（中國藥品生物制品研究所），大鼠IL-6ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D公司)，大鼠SOD試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒、iNOS試劑盒 (南京建成公司)，微量加樣器（eooendorf），ELX800UV酶標檢測儀（BIOTEK），光學顯微鏡（OLYMPUS），Centrifuge5702離心機（EPPENDORF公司），LEICA石蠟切片機。

1.2 動物分組及處理 雄性SD大鼠40只，質量（200±20）g（天津春樂實驗動物提供）。采用隨機數字表法隨機分為4組，每組10只，正常對照組（A組），致傷空白組（B組），致傷依達拉奉8h治療組(C組)，致傷依達拉奉24h治療組（D組）。除A組外，其余各組大鼠制作煙霧吸入性損傷模型（根據謝爾凡等的方法[3]）。模型制作成功后，C組及D組腹腔注射依達拉奉（9mg/kg），B組同時腹腔注射等量生理鹽水。模型制作及給藥過程中無大鼠死亡等意外情況發生。

1.3 標本采集 分別于致傷8h及24h后，C組及D組取大鼠腹主動脈血5mL，3000r/min離心15min后取上清液，-20℃冷凍保存待測IL-6、TNF-α。取左肺組織及時保存于-70℃冰箱中待測NO、MOD、SOD、iNOS。以4%的甲醛灌洗肺動脈以固定肺組織，取出右肺，以絲線結扎肺門后置于4%甲醛中固定，留待病理檢查。

1.4 指標檢測及方法 （1）血清IL-6、TNF-α的檢測:參照試劑盒說明書以雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測，依次用pg/mL、ng/L作為單位。（2）肺組織SOD、NO、MDA、iNOS的檢測：濾紙吸干肺組織表面污物，制備肺組織勻漿，考馬斯亮藍蛋白測定法測勻漿液中蛋白濃度。然后參照試劑盒說明書分別測定SOD、NO、MDA及iNOS含量，分別以U/mg、μmol/mg、nmol/mg、U/mg為單位表示。（3）制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片：將以4%甲醛固定好的右肺組織依次進行脫水、石蠟包埋、制作切片，待HE染色后以光鏡觀察。

1.5 統計學處理 所有數據均進行方差齊性檢驗及正態檢驗，±s為表現形式，用SPSS 18.0統計軟件進行統計學處理。P<0.05表示統計學差異顯著。

2 結果

2.1 肺病理切片檢查 光鏡下，A組組織結構無明顯變化，肺泡腔中未見滲出的白細胞，肺泡腔結構清晰，肺泡間隔光滑均勻（圖1）。B組組織可見肺泡間隔明顯不均，不同程度的肺泡萎陷和擴張，大量炎性細胞及紅細胞浸潤肺泡和小氣道，肺泡組織結構不清晰（圖2）。C組（圖3）和D組（圖4）肺組織可見肺泡仍有一定程度的萎陷和擴張，大小形態尚不規則，毛細血管仍充血擴張，管周尚有一定數量的紅、白細胞浸潤，肺泡腔炎性細胞浸潤輕于B組。D組損傷程度又小于C組。

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平的比較 見表1。與A組相比較，B、C、D組IL-6及TNF-α水平明顯升高（P<0.01）。與B組相比較，C、D組TNF-α, IL-6水平明顯降低（P<0.01）。與C組比較，D組TNF-α，IL-6水平明顯降低（P<0.01）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

與A組相比，△P<0.01，#P<0.01，*P<0.01；與B組相比，▲P<0.01☆P<0.01；與C組相比，□P<0.01

組別A組B組C組D組n 10101010TNF-α/(pg/mL) 112.2±3.01379.5±8.03△297.8±5.94#▲199.5±6.59*☆□IL-6/（pg/mL）124.5±2.37356.2±2.34△235.3±6.31#▲145.4±8.77*☆□

2.3 各組大鼠肺組織MDA、NO、iNOS及SOD水平的比較 見表2。與A組比較，B、C、D組MDA、i－NOS及NO水平均升高（P<0.01），SOD水平均降低（P<0.01）。與B組比較，C、D組NO、MDA、iNOS水平均降低（P<0.01），C組SOD水平升高（P<0.05），D組SOD水平明顯升高（P<0.01）。與C組相比，D組NO、MDA、iNOS水平降低（P<0.01），SOD水平升高（P<0.01）。

表2 各組大鼠肺組織MDA、NO、iNOS、SOD水平比較（±s）Tab 2 Comparison of MDA,NO,iNOS,SOD in the lung tissue of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠肺組織MDA、NO、iNOS、SOD水平比較（±s）Tab 2 Comparison of MDA,NO,iNOS,SOD in the lung tissue of rats in each group（±s）

與A組比較，△P<0.01，#P<0.01，*P<0.01，◇P<0.05；與B組比較，▲P<0.01，☆P<0.01，◆P<0.05；與C組相比，○P<0.01，●P<0.05

組別A組B組C組D組n 10101010MDA/(nmol/mg）2.59±0.097.05±0.19△5.05±0.16#▲3.98±0.15*☆○NO/（μmol/mg）0.91±0.192.68±1.06△1.91±0.55#▲1.22±0.64*☆○iNOS/（U/mg）0.82±0.331.92±0.26△1.57±0.34#▲1.37±0.20*☆○SOD/（U/mg）336.64±2.84112.10±1.03◇134.39±2.03◆200.79±2.95●

3 討論

吸入性損傷病情發展迅速，機制復雜，是嚴重威脅燒傷患者生命的臨床常見疑難癥之一。盡管一些細胞因子和炎癥介質被證實在肺損傷和全身繼發性損害中有一定作用，但在抑制過量炎癥介質和細胞因子方面的問題一直未能得到有效解決，因此，尋找可行有效的抗炎藥物及其探索具體使用方法就成為我們當前共同面臨的難題。

依達拉奉是一種新型的自由基清除劑，可抑制脂質過氧化。因其對腦細胞有保護作用，臨床上廣泛應用于急性腦梗死患者[4]。研究發現其還可對腸缺血再灌注等有氧自由基參與的疾病有保護作用[5]。另有文獻報道，依達拉奉可使大鼠組織中MDA、 TNF-α水平降低，肝內iNOS含量降低，起到保護肝臟的目的[6]。依達拉奉可能通過減輕自由基對細胞膜糖類及脂質的直接破壞作用，對細胞膜內外蛋白質損傷程度及對細胞核酸的破壞作用，來維持細胞生命周期的穩定，提高抗氧化酶活性。在吸入性損傷的發病過程中，上述破壞作用很重要，所以筆者認為依達拉奉可能對吸入性損傷具有肺保護作用。

本實驗HE病理切片顯示致傷各組大鼠肺泡間隔不均，肺泡形態極不規則，大量炎癥細胞浸潤，表明煙霧致傷模型制作成功。吸入性損傷可延長通氣時間，容易繼發感染，使死亡率增加[7]。吸入性損傷使巨噬細胞過度刺激產生大量氧自由基、IL-6、TNF-α等，致肺毛細血管通透性增加，肺水腫程度加重[8]。另外，吸入性損傷使中性粒細胞等炎癥細胞產生釋放IL-6、TNF-α等多種炎性介質及細胞因子，使血管通透性增高，滲出增多，小氣道阻塞，使肺水腫程度進一步加重[9]。血漿中IL-6在炎癥性疾病中被視為預示多臟器功能衰竭及死亡的重要標志[10]。本實驗通過血清TNF-α和IL-6水平，來間接反映肺組織炎性損傷的程度。根據相關文獻報道[11]，采用腹腔注射依達拉奉9mg/kg作為實驗劑量。實驗結果顯示，B、C、D組血清IL-6、TNF-α水平較A組升高，其中C組較B組水平有所降低，D組又較C組低。提示依達拉奉對吸入性肺損傷有保護作用。

吸入性損傷刺激自身抗氧化機制啟動，使生理狀態下就存在于體內的超氧化物歧化酶SOD活性增加，其活性的高低表示機體抑制氧自由基能力的強弱。通過檢測MDA（又稱脂質過氧化物酶）的活性高低可間接反映組織受自由基攻擊導致脂質過氧化的程度[12]。NO是一種致炎因子，少量的內源性的NO能使血管擴張，改善微循環，能對肺組織起保護作用；但過量的NO會導致巨噬細胞釋放炎性介質，進一步導致呼吸爆發，損傷肺組織[13]。肺組織中的iNOS的表達能影響NO的生成，并且提高SOD的活性及減少其消耗，能有效地發揮肺保護作用，本實驗通過檢測NO及iNOS的活性高低反映組織受損傷的程度[14]。實驗結果顯示，B、C、D組肺組織MDA、NO、iNOS水平較A組明顯升高，SOD水平平均降低。肺組織MDA、NO、iNOS水平C組和D組較B組低，D組又較C組低，SOD水平C組和D組較B組高，D組又較C組高。病理顯示B、C、D組肺泡結構不清晰，大量紅白細胞浸潤，其中B組損傷最嚴重，C組與D組損傷較B組輕，D組損傷程度又小于C組。所有結果顯示依達拉奉不僅減低了由煙霧吸入性損傷引起的促炎因子IL-6、TNF-α水平，還能降低MDA、iNOS、NO的水平，更能提高具有抗氧化功能的SOD的水平，肺泡結構及炎癥細胞浸潤程度也明顯減輕，說明依達拉奉在抑制炎癥因子的過程中及抗氧化作用中起了重要作用。

本實驗研究證明，依達拉奉可能通過抑制自由基和部分炎癥介質的產生和釋放減輕煙霧吸入性肺損傷大鼠體內炎性反應，對肺組織起到一定的保護作用。但在給藥方式、用藥濃度和用藥時機的選擇上還需深入研究。

（本文圖1～4見封三）

［1］ Yang T,Zhang J,Sun L,et al.Combined effects of a neutrophil elastase inhibitor(sivelestat sodium)and a free radical scavenger (edaravone)on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats[J].Inflamm Res,2012,61（6）:563

［2］ 潘佳容，肖志輝.依達拉奉對新生鼠高氧肺損傷的影響[J].中國實用兒科雜志，2007，22（1）：49

［3］ 謝爾凡，楊宗城，王孰.大鼠煙霧吸入性損傷模型的制作[J].中國實驗動物學雜志，1994，4（4）:219

［4］ Kikuchi K,Kawahara K I,Uchikado H,et al.Potential of edaravone for neuroprotection in neurologic diseases that do not involve cerebral infarction[J].Exp Ther Med,2011,2（5）:771

［5］ Tomatsuri N,Yoshida N,Takagi T,et al.Edaravone,a newly developed radical scavenger,protects against ischemia-reperfusion injury of the small intestine in rats[J].Int J Mol Med,2004,13（1）:105

［6］ Tsuji K,Yoshida H,Kwon A H,et a1.Free radical scavenger（edaravone）prevents endotoxin-induced liver injury after partial hepatictomy in rats[J].J Hepatol,2005,42（1）:94

［7］ Kabalak A A,Yast A C.Management of inhalation injury and respiratory complications in Burns Intensive Care Unit[J].Ulus Travma Acil Cerrahi Derg,2012,18（4）:333

［8］ 郭宏偉，王武軍，廖崇先，等.米力農霧化吸入、靜脈泵人對體外循環肺損傷的預防效果及機制探討[J].山東醫藥，2011，51（38）:6

［9］ Toon M H,Maybauer M O,Greenwood J E,et al.Management of acute smoke inhalation injury[J].Crit Care Resusc,2010,12（1）:53

［10］Enkhbaatar P,Wang J,Saunders F,et a1.Mechanistic aspects of inducible nitric oxide synthase-induced lung injury in burn trauma[J].BURNS,2011,37（4）:638

［11］Koizumi T,Tanaka H,Sakaki S,et al.The therapeutic efficacy of edaravone in extensively burned rats[J].Arch Surg,2006,141（10）: 992

［12］姜凱麗，張錫剛.活性氧在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中的作用[J].中華損傷與修復雜志（電子版），2010，5（2）:249

［13］Pham H,Vottier G,Pansiot J,et al.Inhaled NO protects cerebral white matter in neonatal rats with combined brain and lung injury [J].Am J Respir Crit Care Med,2012,185（8）:897

［14］Zhu T,Guan X,Zhang W,et al.Dehydroandrographolide succinate inhibits oxidative stress in mice with lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inactivating iNOS[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2012,32（9）:1238