以乙肝病毒核衣殼為靶標的二氫嘧啶類化合物及其作用機制研究進展

楊秀巖，趙國明 ，李 松

(1. 沈陽藥科大學 制藥工程學院，遼寧 沈陽110016;2. 軍事醫學科學院 毒物藥物研究所，北京100850)

乙型肝炎是乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的、以肝臟炎性病變為主的一種傳染性疾病。據世界衛生組織統計，全球有20 億人曾感染過HBV，其中約4 億發展成為慢性乙型肝炎，而中國約占三分之一［1］。目前，治療慢性乙型肝炎的化學藥物主要有核苷類逆轉錄酶抑制劑如恩替卡韋、替比夫定等，但其長期應用易引起病毒耐藥問題，使慢性乙肝的治療仍面臨著巨大的挑戰［2］。核衣殼在HBV 的感染復制過程中與前基因組pgRNA 的包裝、包膜蛋白的識別密切相關，已逐漸成為開發新型抗HBV 藥物的新靶標。二氫嘧啶類化合物(HAPs)是目前發現的唯一一類通過直接作用于核衣殼來達到抑制HBV 復制目的的全新結構類型的化合物［3］，研究其結構特點和作用機制將有助于快速尋找高效低毒的抗HBV 藥物。

1 核衣殼在HBV 復制感染過程中的重要作用

乙肝病毒是一種雙鏈DNA 病毒，屬嗜肝DNA 病毒科(Hepadnavividae)，完整的乙肝病毒顆粒包括外膜、核衣殼和病毒DNA 三個部分，其中核衣殼由核心蛋白構成，呈二十面體對稱結構。核心蛋白存在A、B、C、D 四個同源亞基，主要包括兩個結構域:一個由AA1 ～149 組成的裝配結構域和無結構的調節序列結構域［5-6］。

在HBV 復制感染過程中，核心蛋白首先由前基因組pgRNA 在宿主細胞質中獨立編碼合成，隨后在P 區編碼的聚合酶作用下，與前基因組pgRNA 相互作用，自發地裝配形成未成熟的核衣殼［7-11］;在核衣殼內，pgRNA 繼續完成子代的部分雙鏈環狀DNA 的逆轉錄合成。核衣殼最后通過脫磷酸化、構象變化等修飾成熟后，與包膜蛋白相互作用形成包膜，成熟的病毒顆粒隨之分泌到細胞外繼續感染其他宿主細胞［12-15］。由此可見，核衣殼在HBV 復制感染過程中有著重要的作用，參與了RNA 的包裝及包膜蛋白的識別過程，并提供了子代DNA 的合成場所。

2 作用于HBV 核衣殼的HAPs 類化合物研究現狀

基于核衣殼在病毒復制中起到的作用，近來核衣殼已成為開發全新結構HBV 抑制劑的重要靶標。目前與核衣殼形成相關的活性小分子化合物主要有:King 等報道的芳基丙烯酰胺類化合物如AT-61 和AT-130(圖1)，其通過阻止前基因組pgRNA 進入核衣殼影響核衣殼的正常形成［16］;Asif-Ullah 等報道的三唑并嘧啶類化合物如KSG00011 和KKJ00626(圖1)，可通過抑制乙肝病毒表面蛋白的PreS 部分和核心蛋白之間的相互作用從而抑制乙肝病毒顆粒的生成和分泌［17］。這兩類化合物都是通過阻斷與核衣殼形成相關的過程來發揮其抗HBV 作用，但并非直接作用于核衣殼。

Figure 1 Structures of HBV inhibitors

真正通過直接作用于病毒核衣殼、誤導其裝配達到抑制HBV 感染目的的化合物是2003 年由Deres 等首次報道的芳雜環取代的二氫嘧啶類(HAPs)化合物［3］(圖2，1)。該類化合物也是目前唯一一類明確作用于核衣殼的抗HBV 化合物，代表化合物有HAP1、Bay41-4109、Bay39-5493(圖2)。其中，Bay41-4109 抑制HBV DNA 復制的半數有效濃度(IC50)為53 nmol·L-1;抑制細胞增殖的半數毒性劑量(TC50)為5.06 μmol·L-1，使細胞發生病變的半數有效濃度(CC50)為7 mmol·L-1;使用1 μmol·L-1Bay41-4109 處理HepG2.2.15 細胞后，胞質中HBcAg 水平下降但胞核中HBcAg 水平上升、cccDNA 水平下降。轉基因小鼠肝組織點雜交實驗表明，Bay41-4109 比拉米夫定在肝組織上減少HBV DNA 更有效，而且以15 mg·kg-1和30 mg·kg-1兩個濃度作用在細胞質和肝器官均有極顯著的抗病毒活性，而拉米夫定作用在細胞質上沒差異［18］。另外，體外實驗還發現，Bay41-4109 能夠有效地抑制一些對拉米夫定和阿德福韋耐藥的HBV 毒株［19］。在臨床前研究中，Bay41-4109 和Bay39-5493 表現出了良好的藥代動力學性質。

Figure 2 Structures of HAPs

HAPs 類化合物具有以下的構效關系:該類結構存在一個手性中心，僅R型異構體有活性;N1 上的氫原子對于保持化合物的抗病毒活性是必要的;R2為含氮的芳香雜環活性較好，為苯環時則活性完全喪失;當R3為2-氯-4-氟苯基時活性最強，說明苯環的對位可能需要一個強的氫鍵受體;R4的羧酸甲酯或乙酯結構對該類化合物的活性是必需的;R5通常為甲基，但允許其他基團，這些基團的引入并不能顯著提高化合物的抗病毒活性，但有望改變它的物理化學性質進而改善其生物利用度。為進一步尋找新的高效低毒的抗HBV 化合物，本課題組對2-芳雜環取代基進行了結構的修飾和優化，設計合成了一系列新型的二氫嘧啶類化合物(圖3，2)，并對其體外抗HBV 病毒活性進行評價，獲得了多個活性較好的具有自主知識產權的新化合物［20］，其中化合物3(圖3)的活性最好，其IC50值為0.44 μmol·L-1［21］。鑒于HAPs 類化合物特殊的作用機制，及其體內外活性評價中表現出的高效低毒的性質［22］，該類化合物有希望成為新型的乙型肝炎治療藥物。

Figure 3 New derivatives of HAPs

3 HAPs 類化合物的作用機制

3.1 HAPs 類化合物的結合位點假說

在HBV 復制感染過程中，核心蛋白亞基之間通過48、61、107、183 位半胱氨酸以二硫鍵的方式形成二聚體，二聚體積累到一定濃度之后自我裝配成核衣殼。研究發現，HAPs 類化合物可能是通過作用于二聚體連接處抑制核衣殼正常形成的，其具體的作用位點目前存在3 種假說:第一種假說認為HAPs 的結合位點位于二聚體連接內表面的組氨酸位點附近［3］;第二種假說認為HAPs的結合位點位于二聚體連接的外表面［23］;第三種假說是Zlotnick 等提出的，認為HAPs 的結合位點是在二聚體連接處由Trp10、Phe23、Pro25 和Leu140 等組成的疏水腔內［24］，該疏水口袋的形狀不是平面的，存在輕微的曲率，可與HAPs 類化合物的結構形狀互補，一系列研究證實HBV 衣殼蛋白與溴代的HAPs 類似物的復合物就在相同的位置［25-28］。

3.2 HAPs 類化合物對核衣殼結構及性質的影響

基于第三種假說的研究發現，HAPs 類化合物與核衣殼結合后不影響核心蛋白的翻譯與合成，對核心蛋白亞基的結構并不會造成影響，這一點可通過分子模型對子單元結構的重疊評估得以證實［25］。在該模型中，核心蛋白的四個同源亞基(A、B、C、D)中α 螺旋有無HAPs 結合的RMS 差異為1.0 ～1.7 ?，與游離的核心蛋白的各個亞基的RMS 差異范圍類似，且二十面體中的不對稱單元(AB +CD)中每個核心蛋白亞基的RMS 差異為1 ?，也無明顯變化［24］。

HAPs 類化合物與核衣殼結合后真正影響的是AB +CD 二聚體單元(衣殼二十面體的不對稱單元)的整體排列(圖4，A)，由此引起核衣殼總體結構的變化最終導致其整體性質的變化(圖4，B)。HAPs 與核衣殼結合后可使AB 二聚體向衣殼蛋白表面外繞軸旋轉，使B 鏈的第132 位氨基酸殘基處發生扭曲，使A 鏈α 螺旋132 氨基酸殘基處徑向運動3.4 ?，A 鏈的移動導致五面體頂點(I)處的A 鏈缺失10%的表面積，從而使衣殼蛋白五面體頂點處結構突出。為了維持整體的相同偏移位置，二十面體結構單元同時以CD 二聚體為中心進行協調移動:D 鏈的向面內徑向運動2 ～2.4 ?、C 鏈的向面外徑向偏移1.6 ～2 ?，導致了六面體頂點處的C 鏈與D 鏈交界面25%表面積的掩埋，從而使六面體頂點(II)處結構更為平伏;CD 二聚體以兩個長α 螺旋形成的二聚體界面為軸向衣殼蛋白表面旋轉，使其交界處三面體失去25%的覆蓋表面，導致了三面體頂點(III)更為開放。同時，二十面體結構單元的協調移動使CD 二聚體以兩個長α 螺旋形成的二聚體界面為軸向衣殼蛋白表面旋轉以維持整體的同時偏移，這使D 鏈向面內運動2 ～2.4 ?，C 鏈向面外運動1.6 ～2 ?。綜上所述，HAPs 類化合物使核衣殼五面體頂點處結構的突出、六面體頂點處結構的平伏以及三面體頂點的開放，最終導致衣殼表面的平面性發生了變化。研究還發現，HAPs類化合物可通過作用于二聚體交界面以四個螺旋束為中心柔性的C 末端，穩定衣殼中的二聚體結構，提高其裝配動力學水平，促進其錯誤裝配。

以上的變化可通過核衣殼平均密度圖(圖5)子單元結構的重疊評估得以證實［24］，HAPs 的存在使衣殼外部由AB 二聚體形成的五面體頂點處結構密度明顯增大，且HAPs 使CD 二聚體不再呈現放射狀，其六面體頂點處的結構密度較為松散。這不僅能夠引起已形成的正常核衣殼構象變化，使其不能穩定存在;而且能夠促進形成“膨脹”的不穩定的衣殼結構，并致使新的穩態多聚體的形成［27］。

Figure 4 Blue，-HAPs;red，+HAPs;a yellow sphere at each C chain indicates the putative HAPs site

Figure 5 Structural effects of HAPs are visible in the electron denties of the capsid structures

3.3 化合物濃度對核衣殼形成的影響

研究發現，HAPs 類化合物濃度的不同對二聚體的含量和核衣殼的形成產生的影響是不同的。在低濃度下即HAPs 與二聚體的濃度之比小于1∶2 時，二聚體含量減少，正常核衣殼結構減少，錯誤裝配的核衣殼含量增多，大部分表現為擴大、較為松散、甚至不封閉的空心衣殼結構;當HAPs 的量增多即HAPs 與二聚體達到1∶2 時，二聚體消失，核衣殼錯誤組裝成不規則的管狀聚集結構;當加入高濃度的化合物，即HAPs 與二聚體達到最大值1∶1 時，衣殼結構基本解聚，只有少數解聚衣殼殘體，聚集成團的不規則卷曲結構增多且體積增大［28-31］。由此可見，HAPs 類化合物的存在，無論其濃度大小，都會影響核衣殼的正常形成，這種現象與HAPs 的作用機制是一致的。

核衣殼是HBV 子代DNA 的合成場所，并參與RNA 的包裝及包膜蛋白的識別過程，在HBV復制感染中起到了重要作用。以核衣殼為靶點的HAPs 類化合物結構特點及特殊機制的研究，在分子水平上闡述了其變構激活及其誤導HBV 衣殼裝配的作用機制，開辟了抗HBV 藥物研究的新領域、新思路，將有助于快速尋找高效低毒的HBV 藥物，為征服慢性乙型肝炎帶來新的希望。

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