微山湖河蟹養殖水域可培養好氧異養細菌多樣性調查

楊 軍， 毛慧文， 王玉芹， 孟榮江， 李羅英， 周 晶

(曲阜師范大學 生命科學學院， 山東 曲阜 273165)

微山湖是南四湖的別稱，由微山、邵陽、南陽、獨山四個彼此相連的湖泊組成，即廣義的微山湖，承接蘇、魯、豫、皖4省的來水，南北全長230 km，寬6.8～27.6 km，流域面積31 700 km2，主體屬山東省濟寧市，是中國第六大淡水湖，也是中國北方最大的淡水湖.該湖物產豐富，水資源門類齊全，內有豐富的礦產資源，是中國重點煤炭基地之一，也是國內著名風景旅游區之一.異養細菌是水生態系統的分解者和小型濾食性動物的餌料，在湖泊生態系統的物質循環和能量流動中具有重要的作用[1-3].同時，水體的生態狀況不同，細菌群落的組成也有差異，且現在有關微山湖的研究報道較少，因而，本文研究了異養細菌群落組成的差異，對微山湖河蟹養殖水域細菌群落的時空分布進行分析，以期為微山湖的水環境保護、漁業資源可持續發展提供理論依據.

1 實驗材料和方法

1.1 培養基

LB液體培養基，LB富集固體培養基.

1.2 水樣、泥樣采集

于2010年11月5日，微山湖河蟹養殖區(北緯34°35′45″，東經117°16′20″)，水樣在水面下30 cm處采集，表層泥樣用日產Ekman Birge采泥器采集.

1.3 微山湖中可培養異氧細菌的的計數和鑒定

1)采用10倍稀釋法對水樣梯度進行稀釋；取各梯度稀釋液分別涂布在LB固體培養基上進行富集培養；25℃培養至形成菌落.

2)密集觀察菌落形態[4-9]，并進行群落統計，即根據菌落的表面形狀、隆起狀況、邊緣形狀、色澤、透明感來判斷菌落類型，結合細胞形態、革蘭氏染色及接觸酶和氧化酶反應特性進行生物多樣性的分析.

3)選擇具有獨特形態的優勢菌落，純化后進行生理生化試驗，按《常見細菌系統鑒定手冊》，并參照Bergey氏細菌鑒定手冊進行鑒定.

1.4 群落多樣性分析

群落多樣性用豐度(S) 、優勢度(P)、Simpson指數(L)和Shannon-Wiener指數(H)來表示.具體計算方式如下.

S：用樣品中所含的不同形態特征的菌落種類數來表示.P：用某一類型的菌落數所占的比例來表示，即Pi=ni/N.L：指樣品中隨機得到的兩個分離物為同一類型菌落的概率.L越小，表示種群越豐富，種群分布越均勻.

H是反映群落多樣性與均勻度的復合參數.H越大，表示生物多樣性越高.

其中S為樣本中不同類型的菌落數量，ni為樣本中某一特定類型菌落的數量，pi為某一特定類型的菌落數量占總菌落數的比例，N為樣本的菌落總數[8].

2 結果與分析

2.1 微山湖河蟹養殖水域中可培養異氧細菌的計數

于2010年11月5日，對微山湖河蟹養殖區(北緯34°35′45″，東經117°16′20″)水體和表層底泥中可培養異養細菌進行了分離,發現作為富營養化湖泊的微山湖,水體中可培養異養細菌的數量很多，全湖平均值有1.70×104cfu /mL，一般認為自然水體中細菌總數100～1000cfu/mL為清潔水，大于105cfu/mL則為極不清潔水，這說明微山湖河蟹養殖區水質污染嚴重：有機污染物處于較高的水平，這就導致有機營養型的異養細菌數量很多.這與近年對其湖水有機物超標率達60%以上，湖水富營養化程度嚴重的研究結果相似.另外，采樣期間氣溫較低，細菌的繁殖速度降低，而可培養異養細菌數量卻不低，這就更加反映了其富營養化程度的嚴重性；另一方面也可能是由于氣溫較低，不利于藻類和原生動物的繁殖，而微山湖又是許多鳥遷徙必經的中轉站，據調查，僅9-10月南北往來或中途在此居留覓食的旅游鳥就有96種，綜合各因素，導致采樣期間養殖區內藻類和原生動物的生物量不十分豐富，使水體中異養細菌可利用的可溶性有機碳含量較高.

表層底泥中可培養異樣細菌的數量平均為1.2×105cfu/g(以干泥計，下同)，從采樣時間看，氣溫較低，細菌的繁殖速度也會隨之降低，但此季節底泥中微生物的生物量仍相對較高，這更加說明底泥中有機污染程度嚴重，當然也可能是由于底棲原生動物不活躍的原因造成的.

2.2 菌落形態觀察和群落統計

微山湖水體中的可培養異養細菌的菌落類型很少，在從河蟹養殖區水體和表層底泥中分離到的25株菌的初步鑒定過程中，我們得到的結果是：2，11，19，20這4株菌屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)，4屬假單胞菌屬(Pseudomonas)；1，3，6，8，13，14，15，17，23這9株菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)；8屬于硝化桿菌屬(Nitrobacter)；5，9，12屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)；10，16，18，21，22，24，25屬于鏈球菌屬(Streptococcus).

2.3 微山湖河蟹養殖水域可培養異養細菌的群落多樣性

對微山湖河蟹養殖水域可培養異養細菌的生態調查見表1、2.表中結果顯示，水體中存在的主要是革蘭氏陽性菌 (占93%左右)，以芽孢菌屬、鏈球菌屬和氣單胞菌屬占優勢，革蘭氏陰性菌較少，球形菌較少，且沒有產色素的菌.芽孢桿菌的比例相對較高，平均43.75%,這可能與季節轉換期溫度變化較大，對環境適應能力強的芽孢菌能較多地存活下來有關.

另外，我們還看到，底泥中存在的主要是革氏陰性菌(占62.5%)，以鏈球菌屬占優勢(占62.5%)，多桿狀或棒狀菌，產色素菌相對較高，占44.4%.底泥中只含有3種類型的菌落，說明濟寧微山湖中異養細菌的種群不豐富，物種多樣性較差.

調查還發現微山湖河蟹養殖水域優勢菌的優勢度高, 多樣性指數低(表3).水體中優勢菌的優勢度為43.75%，多樣性指數H為1.542.底泥中優勢菌的優勢度為55.56%, 多樣性指數H為0.994 9.微山湖河蟹養殖水域異養細菌分布的特點是以有芽孢的革蘭氏陽性桿菌占絕對優勢(93%左右)，革蘭氏陰性菌很少，多為氣單胞菌屬或鏈球菌屬，這與我國其他淡水湖泊細菌群落有所不同，這可能是由當地養殖區的特殊環境造成的.

總之，對微山湖河蟹養殖水域中細菌多樣性和群落結構的研究有助于對其水環境的綜合評價及治理提供參考，也為對微山湖微生物資源的進一步了解和開發打下了基礎.

3 討論

3.1 水溫對水域異養細菌分布的影響

溫度是影響生物酶活性的重要因子，從季節變化看，水溫增加對細菌增殖具有一定的促進作用，這與其它很多研究者調查結果一致[10]，在此次調查期間內，11月份為初冬季節，水溫較低，水環境中的很多營養物質比較難以利用，再加上水產動物和植物較少，這也許是影響此次水域異養細菌多樣性分布的主要原因.

3.2 河蟹養殖對水域異養細菌數量的影響

研究報道魚類養殖產生的殘餌、糞便及殘骸等可造成底泥有機質富集，與之相比，本研究水域有機質分布便呈現較高的分布特點.有機質含量的高低形成了與之相應的異養細菌豐度，與已有研究報道的有機質可刺激細菌生長[11]的結果一致.

3.3 河蟹養殖對水域異養細菌多樣性的影響

已有研究顯示，養魚場和對照點底泥細菌群落結構存在較大差異，養魚場底泥革蘭氏陰性菌比對照點革蘭氏陰性菌所占比例高，對照點革蘭氏陽性菌往往占多數.如 Chelossi 等[12]研究發現沿海養魚場沉積物中有超過30%的革蘭氏陰性菌，對照點( 距養殖場200 m)革蘭氏陰性菌很少，革蘭氏陽菌占81%.Vezzulli等[11]對西地中海海區一養魚場沉積物微生物群落的研究發現，養殖區沉積物中異養細菌CBF(Cytophaga/Flexibacter-likebacteria)占優勢，且存在弧菌等病原菌，而對照點(距養殖場200 m)革蘭氏陽性菌數量達到總菌數的90%.本研究結果顯示，微山湖河蟹養殖水體中優勢菌的優勢度為43.75%，多樣性指數H為1.542.底泥中優勢菌的優勢度為55.56%，多樣性指數H為0.9949.微山湖河蟹養殖水域異養細菌分布的特點是以有芽孢的革蘭氏陽性桿菌占絕對優勢(93%左右)，革蘭氏陰性菌很少，多為氣單胞菌屬或鏈球菌屬，研究證明了污染物的長期排放將降低自然生態系統中微生物多樣性，該結果也在本研究中得到了佐證.

[1]Heath R T, Munzwar M. Significance of the microbialfood web to carbon and phosphorus dynamics in Lake Hur [J]. International Association of Theoretical and Applied Limnology, 2006, 29(13): 1199-1204.

[2]Jennifer M D, Justtine A L, Michael L M,etal. Microbial distributions and the impact of phosphorus on bacterial activity in Lake Erie [J]. Journal of Great Lakes Research, 2004, 30(1):166-183.

[3]曾巾, 楊柳燕, 肖琳, 等. 湖泊氮素生物地球化學循環及微生物的作用[J]. 湖泊科學, 2007, 19(4): 382-389.

[4]曾佳, 梁小兵, 陸婷. 淡水湖泊中類蛭弧菌的分離方法[J]. 礦物學報, 2010, 30(1): 77-82.

[5]曹海鵬, 楊先樂, 錢云云, 等. 異育銀螂腸道蛭弧菌的分離及其生物學特性的研究[J]. 微生物學通報, 2007, 34(1): 52-56.

[6]孔祥平, 包木太, 馬代鑫, 等. 油田水中細菌群落分析[J]. 油田化學, 2003, 20(4): 372-376.

[7]吳根福, 虞左明, 吳潔, 等. 杭州西湖水域可培養異養細菌的群落多樣性[J].生物多樣性, 2003, 11(6): 467-474.

[8]陳梅娟, 蔣進元, 周岳溪, 等. 自養硝化細菌的分離、鑒定及系統發育分析[J]. 環境科學研究, 2010, 23(3): 341-345.

[9]萬歡, 吳根福. 京杭大運河杭州段水體中微生物生理群生態分布研究[J]. 農業環境科學學報, 2006, 25(6): 1581-1587.

[10]劉晶晶， 杜 萍， 曾江寧，等. 象山港紫菜區和網箱區沉積物異養細菌的生態分布[J]. 水 產 學 報, 36(10):1585-1590.

[11]Vezzulli L，Chelossi E，Riccardi G，etal． Bacterial community structure and activity in fish farm sediments of the Ligurian sea (Western Mediterranean)[J]．Aquaculture International，2002，10(2) : 123-141.

[12]Chelossi E，Vezzulli L，Milano A，etal． Antibiotic resistance of benthic bacteria in fish-farm and control sediments of the Western Mediterranean [J]．Aquaculture，2003，219(1-4) : 83-97.