異養同化降解氯代烴的研究現狀、微生物代謝特性及展望

張浩，邢志林，汪軍，趙天濤

1 重慶理工大學 化學化工學院，重慶 400050

2 重慶市環境科學研究院，重慶 401147

氯代烴 (Chlorinated hydrocarbons，CAHs)，包括氯代烷烴、氯代烯烴和氯代芳烴，其作為重要化工原材料和有機溶劑在工業生產和生活中被廣泛使用[1]。由于CAHs存儲和處置不當，造成了世界范圍內工業園區、冶金礦業、醫藥企業等場地及地下水的嚴重污染[2-3]。美國環保局對39個小城鎮地下水水源進行檢測，在已處理和未經處理的地下水中都發現了11種CAHs[4]，德國Bitterfeld地區經過近百年的化學工業發展，土壤和地下水受到了CAHs的嚴重污染，涉及的土壤面積高達25 km2，約有2億m3的地下水遭受污染[5]。我國“水中優先控制污染物”中前 9種均為 CAHs，且CAHs具有潛在的“三致” (致癌、致畸、致突變)效應和遺傳毒性效應，對人類健康和生態環境構成重大威脅[1]。盡管 CAHs的污染控制已經持續研究了60多年，但當前治理現狀依然不容樂觀。因此，采取有效措施減少環境中的CAHs污染迫在眉睫。

生物法作為一種降解高效、環境友好和成本較低的修復方式，在CAHs的去除中一直備受關注[6]。厭氧還原脫氯、好氧共代謝和異養同化是CAHs生物降解的主要途徑[7]。在嚴格厭氧條件下，CAHs作為電子受體，還原性物質作為電子供體，通過水解作用或親核反應脫去氯原子的過程即為厭氧還原脫氯[8]?？蒲泄ぷ髡哚槍捬趺撀乳_展了廣泛系統的研究[9-11]，包括厭氧脫氯相關微生物、脫氯機理、降解酶及影響因子等。厭氧脫氯主要發生在三氯乙烯 (Trichloroethylene，TCE)、四氯乙烯 (Perchloroethylene，PCE)、三氯苯 (Trichlorobenzenes，TCBs) 和六氯苯(Hexachlorobenzene，HCB) 等高氯取代烴中，這些CAHs在還原脫鹵酶的作用下轉化為低氯取代物[12]。典型厭氧脫氯微生物有脫鹵桿菌屬Dehalobacter、脫鹵擬球菌屬Dehalococcoides、脫硫桿菌屬Desulfifitobacterium、地桿菌屬Geobacter[13]，但只有Dehalococcoides可實現氯原子的全部脫除。好氧共代謝是CAHs生物降解的另一途徑，微生物通過代謝生長基質誘導細胞產生單加氧酶或雙加氧酶實現CAHs的降解[14]，CAHs不作為碳源和能源也不能被微生物轉化為生物質[15]。好氧共代謝研究持續多年，涉及共代謝降解微生物的篩選、生長基質的優化以及共代謝降解機理的解析[7,16]。最典型共代謝微生物為甲烷氧化菌Methanotrophs[17]。這些研究為 CAHs污染的修復提供了重要的理論基礎，基于這些理論，研究者正開展CAHs的場地修復工作[7]。

異養同化作用是CAHs降解的第3種途徑，與厭氧脫氯和共代謝降解相比，異養同化過程避免額外添加有機物，同時不會產生二次污染，在CAHs污染降解中具有重大應用潛力[18]。當前，已報道可通過微生物異養同化作用降解的 CAHs種類十分有限，利用異養同化作用實現場地修復的研究還未有報道。開展 CAHs異養同化過程的系統性認識，明晰 CAHs異養同化規律，對于如何強化、應用異養同化過程，擴大CAHs的修復途徑將具有重要的推動作用。國內外許多研究對厭氧脫氯和好氧共代謝過程已進行系統性總結[9-11,15-16]，對于如何優化調控厭氧脫氯和好氧共代謝過程有了一定的依據。而關于CAHs異養同化過程的總結還未見報道?；诖?，本文將對異養同化降解的研究現狀進行系統性總結，包括可發生異養同化CAHs的類型、降解特性，典型氯代烴異養同化的降解機理、相關微生物及其降解酶，并基于異養同化降解CAHs存在的問題提出未來重點關注的發展方向，將為CAHs異養同化的深入研究和場地修復實踐提供重要的理論依據。

1 CAHs異養同化過程及優勢

CAHs三種代謝途徑的特點如表 1所示。厭氧還原脫氯過程CAHs作為電子受體，還原性物質作為電子供體，通過水解作用或親核反應脫去氯原子。所有氯代烴均可發生還原脫氯，但隨著分子中氯原子數量的減少，還原脫氯的速率會迅速降低[19]。另外，厭氧脫氯發生環境要求苛刻，菌群數量和活性往往較低，且還需要不斷添加電子供體。因此，該過程極易造成低氯取代物和其他副產物的大量積累[20-21]。好氧共代謝降解過程中CAHs被細胞代謝生長過程中產生的單加氧酶或雙加氧酶降解，CAHs不為微生物提供能源和碳源，該過程需要添加大量生長基質，極易造成環境的二次污染；共代謝降解產生的環氧化合物和氯代醛類化合物也會造成微生物的活性降低；同時降解過程中生長基質和CAHs污染物會與關鍵酶競爭活性位點，產生競爭性抑制[22]。盡管已有厭氧脫氯和好氧共代謝過程用于場地修復的案例[23]，但由于上述問題的限制，往往造成處理成本過高、修復效果差和修復時間長等問題。因此，面對日益嚴格環保需求，擴大CAHs的生物修復途徑已十分必要。

CAHs異養同化作為另一種途徑為場地修復提供了新的選擇，異養同化過程中微生物以CAHs為唯一碳源和能源進行生長，將其礦化為 H2O、CO2和Cl–等小分子化合物并合成自身生物質[24]。CAHs在微生物細胞內的異養同化過程如圖 1所示。CAHs通過主動運輸進入微生物細胞內，在酶的作用下發生轉化，為微生物生長提供必需的碳源和能源，同時中間產物通過絲氨酸途徑轉化為生物質，代謝生成的氯離子最終排出細胞外。與好氧共代謝和厭氧脫氯相比，異養同化優勢體現在以下方面：(1) 避免有毒中間產物的生成，特別是對降解酶和微生物有毒害作用的環氧化合物，同時異養同化避免產生低氯取代烴[21]。(2) 無需添加額外生長基質，無二次污染，同時避免了在代謝過程中生長底物與 CAHs競爭活性位點[22]以及生長底物對氧的消耗[21-22,25]。如何利用 CAHs異養同化過程也將是未來場地修復研究的熱點。

表1 CAHs三種代謝途徑的特點[26]Table 1 Characteristics of three metabolic pathways of CAHs[26]

圖1 微生物細胞中典型氯代烴異養同化過程[27]Fig. 1 Assimilation of CAHs in microbial cell[27].

2 CAHs異養同化降解研究概述

2.1 可發生異養同化降解的CAHs種類

目前，研究報道可通過異養同化途徑降解的CAHs有一氯甲烷 (Chloromethane，CM)[28]、二氯甲烷 (Dichloromethane，DCM)[29-30]、三氯甲烷(Chloroform，CF)、四氯化碳 (Carbon tetrachloride，CT)[31]等氯代烷烴；氯乙烯 (Vinyl chloride，VC)[32-33]、順式二氯乙烯 (cis-1,2-dichloroethene，c-1,2-DCE)[21,34]、反式二氯乙烯 (trans-1,2-dichloroethylene，t-1,2-DCE)[18]、TCE 等氯代烯烴；氯苯 (Chlorobenzene，CB)[35-36]、1,2-二氯苯(1,2-dichlorobenzene，1,2-DCB)[37]、1,4-二氯苯(1,4-dichlorobenzene，1,4-DCB)[38]、1,2,3-三氯苯(1,2,3-trichlorobenzene，1,2,3-TCB)、1,3,5-三氯苯(1,3,5-trichlorobenzene，1,3,5-TCB)[39]等氯代芳烴。典型CAHs的Cl/C比結果如圖2所示。隨氯取代程度的增大，氯代烷烴異養同化降解性急劇下降，除 CT外，其他全氯代烴無法通過異養同化途徑降解。所有氯代甲烷都可作為微生物碳源和能源被降解[28-29,31]，表明氯代烷烴可以廣泛地被微生物同化。除四氯乙烯外，其他氯代乙烯均可發生異養同化降解，發生異養同化的氯代烯烴Cl/C的比值低于 2。氯代芳烴中，氯取代程度小于3的氯代芳烴可通過異養同化降解是廣泛報道的。CAHs中氯取代程度越高，化合物電負性越強，在有氧條件下難以發生異養同化[40]。綜上所述，能通過異養同化途徑進行降解的CAHs以代氯取代烴 (1–3個氯原子) 為主，準確認識場地CAHs污染特性也是開展場地修復的重要前提。

圖2 典型氯代烴Cl/C比Fig. 2 Cl/C ratio of typical CAHs.

2.2 CAHs異養同化的微生物及降解特性

已報道CAHs異養同化微生物主要來自污染場地土壤、地下水、化工廢水處理廠的活性污泥以及人工馴化的專性降解菌[31,38]，這些微生物包括純菌株和混合菌，混合菌相對于純菌對污染物具有更好的降解效率，且對環境具備更好的適應性[20]。已分離的典型CAHs異養同化降解菌屬主要有生絲微菌屬Hyphomicrobium、假單胞菌屬Pseudomonas、分支桿菌屬Mycobacterium、不動桿菌屬Acinetobacter、類諾卡氏菌屬Nocardioides、芽孢桿菌屬Bacillus、寡養單胞菌屬Stenotrophomonas等，大多數的降解菌只對特定的CAHs產生作用，但也有少部分降解菌如銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosastrain S1-2[18]、腸桿菌Enterobactersp.SA-2、Pseudomonassp.SA-6[39]、紅球菌Rhodococcus phenolicusG2PT[41]等可降解兩種及以上的 CAHs。對已分離篩選具有 CAHs異養同化作用的微生物進行了系統總結，結果如表2所示。

2.2.1 氯代烷烴異養同化微生物

已報道分離的氯代烷烴異養同化降解菌屬主要包括Hyphomicrobium、Pseudomonas、Nocardioides、氨基桿菌屬Aminobacter、甲基桿菌屬Methylobacterium、副球菌屬Paracoccus、Bacillus等。氯代烷烴類污染物分布廣泛，多種氯代烷烴均可作為微生物底物，研究人員從多種環境分離了這些菌株。McAnulla等[42]從陸地、河口、海洋中分離出 6株屬于Hyphomicrobiumsp.、Aminobactersp.和Nocardioidessp.的 CM降解菌。Jeffra等[28]從海水中分離的菌株Leisingera methylohalidivoransMB2T不僅能以CM為唯一碳源進行生長還能同化溴甲烷和碘甲烷。Doronina等[43]從污染地下水中分離出一種新型的革蘭氏陰性菌株Paracoccus methylutenssp.nov. DM12，該菌株可以 DCM為唯一碳源。而 Wu等[30]從制藥污水中分離出的 DCM 降解微生物芽孢桿菌Lysinibacillus sphaericuswh22，還能以 1,2-二氯乙烷 (1,2-dichloroethane，1,2-DCA)、氯溴甲烷(Chlorobromomethane，CBM)、1,1,1-三氯乙烷(1,1,1-trichloroethane，1,1,1-TCA) 和 TCE為唯一碳源進行生長。CF和CT等高氯代烷烴，難以作為微生物生長的唯一碳源，Olaniran等[31]分離出兩株能以底物濃度為0.1% (W/V) 的CF和CT為唯一碳源和能源的降解菌Bacillus(GBB416) 和Pseudomonas(GBB417)，這是唯一一篇報道的對CT具有異養同化降解功能的菌株，實現了高氯代烷烴異養同化降解研究的突破。氯代烷烴類污染物分布廣泛，多種氯代烷烴均可作為微生物底物，在氯代烷烴污染場地，異養同化降解是十分有效的修復途徑。

表2 異養同化微生物的生長及代謝特征Table 2 Growth and metabolic characteristics of CAH-assimilating microorganisms

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2.2.2 氯代烯烴異養同化微生物

氯代烯烴在環境中的檢出率較高，毒性更大，研究人員在污染場地中分離出許多氯代烯烴異養同化降解菌，主要包括Pseudomonas、Mycobacterium、Nocardioides、Stenotrophomonas和蒼白桿菌屬Ochrobactrum等。大多數氯代烯烴異養同化微生物是以特定的基質為生長底物、通過長期馴化衍生的特異性菌株。Verce等[44]報道了第一株以 VC為唯一碳源的Pseudomonas aeruginosaMF1，該菌株以VC為唯一基質長期馴化篩選獲得，菌株MF1不僅具有長時間的耐饑餓能力，還具有很強的VC耐受能力，當VC濃度增加到7.3 mmol/L時對生長也無抑制作用。除純菌外，Singh等[20]通過長期馴化從污染場地中篩選出一組由Mycobacteria和Rhodococcus構成的混合菌，當VC濃度為50–250 μmol/L時可被混合菌迅速降解。相同功能的不同菌株降解能力差異明顯，Elango發現從高濃度VC環境分離出的羅爾斯通菌Ralstoniasp.TRW-1對VC的降解能力是其他分枝桿菌的3–10倍[45]。

除VC外，c-1,2-DCE也能作為微生物生長的唯一碳源。Schmidt等研究了污染地下水中c-1,2-DCE的異養同化過程，在多種條件下觀察到了c-1,2-DCE生物降解過程的穩定性同位素分餾，通過蛋白質的形成證明了 c-1,2-DCE可作為微生物生長的唯一碳源和能源[21]。隨后，Olaniran等利用富集培養技術從尼日利亞和南非的污染場地分離出5株c-1,2-DCE的異養同化降解菌，分別屬于棒狀桿菌屬Corynebacteriumsp.、Bacillussp.、伯克氏菌屬Burkholderiasp.、微球菌屬Micrococcussp.和Pseudomonassp.，這些菌均可以 c-1,2-DCE為唯一碳源和能源，降解率為59%–86%[46]。此外，Bradley等[47]從黑臭水體中分離出一組 c-1,2-DCE降解混合菌，在濃度為50 μmol/L的條件下可以實現c-1,2-DCE的完全降解并檢測出大量 CO2的生成，表明該混合菌具有高效的c-1,2-DCE同化能力。盡管VC和DCE容易作為微生物碳源被異養同化降解，但隨著氯取代程度的增大，異養同化降解難度急劇增大。迄今為止，只發現嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophiliaPM102[48]和Bacillussp.2479[49]具有TCE的異養同化降解能力，還未有直接證據證明PCE可通過異養同化途徑實現降解。因此，在多氯取代烯烴的污染場地，采用異養同化與厭氧還原脫氯結合的修復措施可實現污染物的有效去除。

2.2.3 氯代芳烴異養同化微生物

氯代芳烴作為持久性有機污染物，其異養同化微生物的篩選分離研究已開展多年，研究主要集中在氯取代數小于3的氯苯類有機物。研究人員以CB為唯一碳源，分離篩選的不動桿菌Acinetobactersp.CB001[35]和代爾夫特菌Delftia tsuruhatensisLW26[36]除了能以CB為唯一碳源外，也能以二氯苯 (Dichlorobenzenes，DCBs) 為唯一碳源進行生長。另外，Haigler等[50]從活性污泥中分離出一株以 1,2-DCB為唯一碳源和能源生長的菌株Pseudomonassp.JS100，該菌株也能以CB為唯一碳源和能源進行生長。此外，Monferrán等[37]以1,2-DCB 為唯一碳源篩選的燕麥食酸菌Acidovorax avenae降解污染物范圍更廣，能夠以CB、1,3-DCB和 1,4-DCB為碳源和能源生長。TCBs異養同化降解菌也存在類似的情況，Adebusoye等[39]分離的菌株Enterobactersp.SA-2和Pseudomonassp.SA-6不僅可以異養同化1,2,3-TCB和1,3,5-TCB，也能以1,4-DCB為唯一碳源和能源生長。以上結果表明，氯代芳烴異養同化微生物之間可能存在較高的同源性。

2.2.4 異養同化微生物的生長代謝特性

氯代烷烴異養同化微生物生長 pH值范圍為 6.5–7.7，溫度為 25–30 ℃。當 CAHs濃度為0.1–10 mmol/L時，最大比生長速率范圍為0.05–6.63 h–1，氯代烷烴的平均降解率均在92%以上。在異養同化過程中，生長基質濃度對微生物生長和代謝速率有較大的影響。CAHs濃度過高，產生毒性抑制，微生物生長緩慢；CAHs濃度過低，微生物底物匱乏，限制微生物生長。菌株Hyphomicrobiumsp.MC1在氣相濃度為1%的MC中最大比生長速率為 0.09 h–1，當氣相濃度增到10%時最大比生長速率降為0.04 h–1[51]。此外，不同微生物對CAHs利用效率也具有很大差別，當DCM濃度相同時，菌株HyphomicrobiumDM2和Pseudomonassp. DM1的最大比生長速率分別為0.07 h–1和 0.11 h–1[52]。為進一步解析代謝機理，Wu等[30]從 DCM 異養同化菌株Lysinibacillus sphaericuswh22提取質粒pRC11，并轉移到大腸桿菌中，該重組大腸桿菌菌株能在 5–16 mmol/L DCM的條件下正常生長，表明該基因可能是DCM代謝的關鍵基因。

氯代烯烴作為微生物生長的唯一碳源被廣泛報道[44]，這些氯代烯烴同化微生物的最適生長溫度為 20–37 ℃，pH為 6.5–7.5。當氯代烯烴濃度為0.15–10.00 mmol/L時，微生物最大比生長速率范圍為 0.002–15.720 h–1，降解率在 60%–100%。菌株Pseudomonas aeruginosaMF1以VC為唯一碳源生長時，6 mmol/L的VC在35 d內可完全降解[44]。氯代烯烴異構體同樣影響微生物代謝特性，Olaniran從非洲污染場地中分離出7株DCE異養同化微生物，在 1 mmol/L的 c-1,2-DCE和1.5 mmol/L的t-1,2-DCE為唯一碳源進行生長時，比生長速率分別為 0.014–0.023 h–1和 0.019–0.028 h–1，平均降解率為 70%–75%和 60%–72%，其中t-1,2-DCE培養基中的細胞密度要高于c-1,2-DCE，可能是因為c-1,2-DCE氧化生成環氧化合物具有更高的毒性[18]。與純菌相比，混合菌降解能力更高，Sing分離的混合菌可迅速降解濃度為 50–250 μmol/L的 VC[20]。研究表明含氧量和pH可影響氯代烯烴的異養同化過程，VC降解菌株Pseudomonas aeruginosaMF1在缺氧條件下培養2.5 d，并不能完全恢復在VC上的生長能力，且降解過程中有VC環氧化合物的生成[44]。同樣的，VC降解混合菌在缺氧條件下也有VC環氧化合物生成[20]，表明缺氧狀態使得VC的降解機理可能發生了改變。TCE異養同化降解菌Stenotrophomonas maltophiliaPM102在 pH為中性時降解率可達到90%，而pH降為5時降解率下降到77%[48]。

氯代芳烴異養同化微生物最適 pH值為7.0–7.8，最適溫度為25–30 ℃，當氯代芳烴濃度為0.002–1.000 mmol/L時，微生物最大比生長速率為 0.002–0.420 h–1，降解效率范圍 77%–99%，表明氯代芳烴異養同化微生物的活性差異較大。李明堂等[35]分離的菌株Acinetobactersp. CB001，在0.44 mmol/L的 CB條件下，120 h降解率可達98.2%。該菌株還可同化DCBs，異養同化能力順序為 1,3-DCB>1,2-DCB>1,4-DCB。Monferrán 等[37]以 1,2-DCB唯一碳源篩選的菌株Acidovorax avenae在2 d內可將0.136 mmol/L的1,2-DCB完全降解，釋放全部氯原子。同樣地，菌株Enterobactersp.SA-2和Pseudomonassp.SA-6以1,2,3-TCB(0.44 mmol/L) 和1,3,5-TCB (0.43 mmol/L) 為唯一碳源和能源生長時，約80%–90%的 TCBs可以在200 h內降解，且細胞濃度增加3個數量級[39]。與氯代烷烴和氯代烯烴相比，氯代芳烴降異養同化微生物特異性較低，對多種氯代芳烴均具有降解能力，在復合污染環境中適用性更強?；诋斍皩AHs異養同化降解菌篩選分離和生長特性的研究，絕大多數降解菌具有較強的耐受性和降解能力，能較好地適用于氯代烴類污染物場地的修復工作。

3 典型氯代烴的異養同化降解酶及機理

3.1 氯代烷烴的異養同化

圖3 CM和DCM同化途徑[64]Fig. 3 Assimilation pathways of chloromethane and dichloromethane[64].

MC和 DCM 是異養同化降解研究最多的氯代烷烴，現已充分揭示了兩種氯代烷烴的代謝機理?；谖墨I報道總結的MC和DCM的降解機理如圖3所示。MC和DCM具有相似的代謝途徑，MC首先發生脫氯反應，生成的甲基在CmuA和CmuB甲基轉移酶的作用下轉移到四氫葉酸(Tetrahydrofolate，H4folate) 上形成甲基-H4folate，四氫葉酸連接的中間體在亞甲基-H4folate還原酶、亞甲基-H4folate脫氫酶、甲基-H4folate環水解酶、甲酰-H4folate水解酶的相繼作用下進一步氧化生成甲酸，甲酸在甲酸脫氫酶的作用下生成CO2。此外，中間體亞甲基-H4folate可以通過絲氨酸途徑被微生物同化為自身的組成物質。與MC不同，DCM首先在還原型谷胱甘肽 (Glutathione，GSH) 的作用下失去一個氯原子并與GSH結合生成中間產物S-氯甲基谷胱甘肽，中間會自發生成S-羥甲基谷胱甘肽并最終生成甲醛 (HCHO) 和谷胱甘肽 (圖 4)。形成的 HCHO 分別依賴于H4folate和四氫甲蝶呤 (Tetrahydromethanopterin，H4MPT) 途徑進行代謝，H4MPT降解途徑普遍存在于大多數甲基營養菌中[61]。HCHO 在甲醛活化酶的作用下與四氫甲蝶呤縮合成亞甲基-H4MPT，而亞甲基-H4MPT是絲氨酸循環和大多數微生物同化必需的[62-63]。亞甲基-H4MPT通過亞甲基-H4MPT脫氫酶、甲基-H4MPT環水解酶、甲酰甲基呋喃轉移酶和甲酸脫氫酶的相繼作用最終生成CO2。

圖4 DCM的中間代謝途徑[64]Fig. 4 Intermediate metabolic pathway of dichloromethane[64].

3.2 氯代烯烴的異養同化

氯代烯烴異養同化降解中，只有 VC異養同化代謝機理被系統解析，降解途徑如圖5所示。VC首先在烯烴單加氧酶 (Alkene monooxygenase，AkMO) 作用下轉化為環氧氯乙烯[22]，由輔酶 M轉移酶 (Coenzyme M transferase，EaCoMT) 介導的輔酶M (Coenzyme M，CoM) 進一步與環氧乙烯結合形成2-氯-羥乙基-CoM，2-氯-羥乙基-CoM自發地消除氯原子生成2-酮乙基-CoM，隨后，在CoM-還原酶/羧化酶作用下生成丙二酸半醛和還原性的CoM。丙二酸半醛通過雙官能醛/醇脫氫酶的氧化生成丙二酸，在脫羧酶、輔酶A (Coenzyme A，CoA) 合成酶和 CoA轉移酶的循環中轉化為丙二酰-CoA，最終進入三羧酸循環 (Tricarboxylic acid cycle，TCA)[22]。研究者針對氯代烯烴降解酶展開了深入研究，AkMO和EaCoMT是VC異養同化微生物的重要酶系[33]，Mycobacteriumsp.strain E20降解乙烯的研究中首次發現AkMO[22]，研究還發現其他酶也參與 VC的異養同化過程，Danko等[57]研究證明Ochrobactrumsp.TD菌株中的脫羧酶參與 VC的降解過程，對同化過程酶生成的編碼基因進行了深入分析，發現2–3個ORFs編碼參與MycobacteriumJS60和NocardioidesJS614菌株的CoA合成酶和CoA轉移酶的合成。Chuang等[65]通過蛋白質組學和 RT-PCR確認了VC代謝基因etnA、etnC、etnE和comA與雙功能醇/醛脫氫酶、FAD/NAD(P)H依賴性還原酶/羧化酶和CoA轉移酶的表達過程受到了VC的誘導。這些為 VC異養同化過程的有效調控提供了重要的理論依據。

3.3 氯代芳烴的異養同化

CB、DCBs和TCBs等典型氯代芳烴的異養同化過程具有相似的代謝途徑，同化過程普遍遵循“先開環再脫氯”的降解機制[36]，降解過程如圖6所示。氯代芳烴在雙加氧酶的作用下發生鄰位或間位裂環脫氯，CB被依次氧化生成鄰氯苯酚、3-氯鄰苯二酚，然后在鄰苯二酚 1,2-雙加氧酶的作用下，中間先后經歷鄰位開環、脫氯、氧化等過程，最終將其礦化為CO2和轉化為生物質；1,2-DCB和1,4-DCB分別在1,2-二氯苯雙加氧酶和1,4-二氯苯雙加氧酶等酶的作用下，先后經歷開環、脫氯、氧化后生成脫氯產物 5-氯馬來酸和 2-氯馬來酸[50]。研究表明，參與氯代芳烴異養同化過程的鄰苯二酚雙加氧酶種類很多，葉杰旭等[36]在Delftia tsuruhatensis同化CB過程中發現3-氯鄰苯二酚在鄰苯二酚 1,2-雙加氧酶的作用下鄰位開環生成 2-氯-粘康酸。在有氧條件下黃色桿菌Xanthobacter flavus14p1對1,4-DCB的降解過程中，鄰苯二酚 1,2-雙加氧酶將 3,6-二氯鄰苯二酚轉化為2,5-二氯-粘康酸[60]。菌株Enterobactersp.SA-2和Pseudomonassp.SA-6在降解1,3,5-TCB的過程中，降解 3,6-二氯鄰苯二酚的關鍵酶為鄰苯二酚2,3-雙加氧酶，且菌株SA-2比菌株 SA-6酶活性略高[39]。綜上表明，鄰苯二酚雙加氧酶是氯代芳烴異養同化過程中的關鍵酶。

圖5 VC異養同化代謝途徑[22]Fig. 5 VC assimilation pathway[22].

圖6 典型氯代芳烴異養同化生物降解途徑 (A：CB[36]；B：1,2-DCB[50]；C：1,4-DCB[60])Fig. 6 Assimilation pathway for typical chlorinated aromatic hydrocarbon. (A) Chlorobenzene[36]. (B)1,2-dichlorobenzene[50]. (C) 1,4-dichlorobenzene[60].

3.4 典型氯代烴異養同化降解關鍵基因

不同 CAHs異養同化過程功能基因差異很大，不同CAHs具有不同的特征基因，對特征基因的檢測分析可明晰微生物或環境樣品的異養同化降解功能。典型的CAHs異養同化過程特征基因的引物如表3所示。氯甲烷同化過程的特征基因為cmuA和cmuB[66]，其中cmuA作為分子探針而廣泛應用。Miller等[67]設計了cmuA的引物cmuA802和cmuA1609r用于檢測鹵甲烷降解物。隨后，Nadalig開發了兩個新的反向引物cmuA1802r和MF2，建立了cmuA的qPCR方法并用于研究綠藻球中的氯甲烷降解物[68]。DCM 異養同化特征基因為dcmA，dcmA基因具有高度保守性，開發的引物CFOR/CREV[69]和DMfor/DMrev[70]可準確定量環境中DCM異養同化微生物[71]。VC異養同化的特征基因為etnC和etnE，當前開發的引物可以準確定量功能微生物和地下水環境中特征基因含量[71-72]。氯代芳烴異養同化的特征基因為adhA1，Monferrán等[37]利用引物 17F 和 1406R 證實了菌株Acidovorax avenae對1,2-DCB的代謝途徑。CAHs特征基因的明確，對明晰 CAHs的降解產物、同化途徑和實際污染場地功能微生物的定量工作具有重要的指導意義。

表3 典型CAHs異養同化微生物的功能基因及其引物Table 3 Primers and functional genes of CAHs-assimilation bacteria

4 總結與展望

異養同化作為CAHs的生物降解方式之一為污染場地生物修復提供了可選的修復方案，與其他生物代謝過程相比具有顯著優勢。本文對可發生異養同化的CAHs進行了系統性的總結，對典型CAHs的相關微生物、異養同化降解途徑及其降解酶進行了系統闡述。目前，報道的CAHs異養同化微生物和可降解CAHs的種類較少，已分離的可進行 CAHs異養同化微生物僅有十幾個屬，可作為碳源和能源被微生物利用的CAHs僅限于低氯取代烴，如VC、DCE、DCM和CM，且只有一篇文章報道了TCE的異養同化降解[44]；總結發現，大多數微生物生長條件 (pH 6.5–7.5，25–35 ℃) 均比較溫和，對于極端條件下的微生物研究甚少；另外，CAHs的異養同化研究主要集中在分離的純菌或群落結構簡單的混合菌中，對于實際CHAs的污染場地中，異養同化降解菌的豐度、酶的種類、異養同化代謝強度、環境因子氧氣的影響特性等的信息報道還十分有限；此外，污染場地中氯代烴組成復雜，有些氯代烴無法作為異養同化微生物的碳源和能源，共存氯代烴還會抑制其他氯代烴的同化降解[75]，同化降解過程氯代烴間的相互作用影響還未得到有效解決。這些問題限制了異養同化降解微生物在CAHs污染處理中的應用。因此，面對日益嚴峻的CAHs污染，未來研究中關于CAHs的異養同化要更加關注以下幾個方面：(1) 擴大菌株篩選范圍，獲得具有抗逆性的多種CAHs降解能力的菌株；通過基因工程和酶工程開發工程菌，如已有利用基因工程手段獲得具有CAHs異養同化降解功能的大腸桿菌[30]。(2) 充分利用異養同化降解特點及快速、無二次污染的優勢，開發厭氧脫氯-異養同化，共代謝-異養同化，厭氧脫氯-共代謝-異養同化，物化處理 (鐵還原)-異養同化等聯合 CAHs處理工藝，已有研究發現以 VC為底物可共代謝降解DCE[20]。(3) 利用宏基因組和轉錄組測序等多組學技術，明晰污染場地異養同化微生物基因組信息，解析不同種屬微生物對CAHs的代謝機理[76]。(4) 逐步開展異養同化降解的場地應用，明晰場地環境中異養同化降解的影響因素，建立有效的異養同化實施、監控和模擬方案。

附：縮略詞索引

CAHs：氯代烴，Chlorinated hydrocarbons

TCE：三氯乙烯，Trichloroethylene

PCE：四氯乙烯，Perchloroethylene

TCBs：三氯苯，Trichlorobenzenes

HCB：六氯苯，Hexachlorobenzene

CM：一氯甲烷，Chloromethane

DCM: 二氯甲烷，Dichloromethane

CF：三氯甲烷，Chloroform

CT：四氯化碳，Carbon tetrachloride

VC：氯乙烯，Vinyl chloride

c-1,2-DCE：順式二氯乙烯，cis-1,2-dichloroethene

t-1,2-DCE：反式二氯乙烯，trans-1,2-dichloroethylene

CB：氯苯，Chlorobenzene

1,2-DCB：1,2-二氯苯，1,2-dichlorobenzene

1,4-DCB：1,4-二氯苯，1,4-dichlorobenzene

1,2,3-TCB：1,2,3-三氯苯，1,2,3-trichlorobenzene

1,3,5-TCB：1,3,5-三氯苯，1,3,5-trichlorobenzene

1,2-DCA：1,2-二氯乙烷，1,2-dichloroethane

CBM：氯溴甲烷，Chlorobromomethane

1,1,1-TCA：1,1,1-三氯乙烷，1,1,1-trichloroethane

DCBs：二氯苯，Dichlorobenzenes

H4folate：四氫葉酸，Tetrahydrofolate

GSH：谷胱甘肽，Glutathione

H4MPT：四氫甲蝶呤，Tetrahydromethanopterin

AkMO：烯烴單加氧酶，Alkene monooxygenase

EaCoMT：輔酶M轉移酶，Coenzyme M transferase

CoM：輔酶M，Coenzyme M

CoA：輔酶A，Coenzyme A

TCA：三羧酸循環，1,1,2-trichloroethane