不同時期RNA干擾水通道蛋白4對早期創傷性腦水腫影響的觀察

趙 旭，宋振全，梁國標，李曉明，李 賓，呂 偉，毛振立，雷 偉，劉洪波

在早期腦損傷(early brain injury，EBI)的發病機制中腦水腫的發生和血腦屏障(blood－brain barrier，BBB)的破壞起重要作用［1］。大量研究證實，腦水腫的發生與水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)緊密相關［2－3］。創傷性腦水腫的早期治療十分關鍵，而由于其復雜的機制，人們對傷后AQP4的調節存在爭議，對于早期腦損傷的機制也有待進一步探索。許多研究證實應用RNA干擾的方法可有效沉默體內外AQP4和mRNA的表達［4］，筆者希望探索在不同時期抑制AQP4蛋白的表達對早期創傷性腦水腫發生發展的影響及相關機制。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 動物分組 健康成年雄性Wistar大鼠90只，體質量250～300g。實驗動物隨機數字表法分為:假手術組、單純創傷組、傷前6h給藥組、創傷即刻給藥組和傷后6h給藥組。

1.2 主要試劑及儀器 采用化學合成法合成的大鼠siRNA(Aqp4-rat-725:5’GCAGUUAUCAUGGGAAACU TT3’，5’AGUUUCCCAUGAUAACUGCTT3’，上海吉瑪生物工程有限公司;實驗證明，腦室給藥后6h可有效降低腦內AQP4蛋白和mRNA的含量，驗證過程略)。

2 實驗方法

2.1 TBI模型制備 參照改良Feeney’s自由落體硬膜外撞擊法制作局灶性腦挫裂傷模型。采用水合氯醛350mg/kg腹腔內注射麻醉，將大鼠俯臥位固定于腦立體定向儀上。以囟門后約1mm，旁開2.5mm為中心以磨鉆磨一直徑約5mm的骨窗，暴露硬腦膜。將撞桿頭端(直徑3mm)置于骨窗硬腦膜，其外為垂直聚乙烯套管，用40g打擊棒沿外周套管從25cm高度自由落下沖擊聚乙炔圓錐，下落沖擊力1 000cm×g，造成大腦半球局部腦挫裂傷。

2.2 各實驗組處理 分別于傷前6h、創傷即刻和傷后6h向左側腦室注入AQP4 siRNA20μl［10μM，將0.25OD AQP4 siRNA溶于20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水中］;單純創傷組在創傷即刻向左側腦室注入生理鹽水20μl;假手術組不行創傷，開窗后腦室注入20μl生理鹽水，縫合。然后進行腦組織含水量測定，血腦屏障通透性測定，灌注、取材及包埋，HE標本制作及觀察，AQP4、ZO-1和MMP9蛋白免疫組織化學觀察，原位雜交方法檢測AQP4 mRNA的表達。

2.3 數據處理

所測數據采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 在精神、運動和行為等方面，各創傷組間未見明顯差異。局灶性腦挫裂傷形成后，大鼠平均呼吸暫停時間約15s。有9只大鼠在硬膜外撞擊后死亡，死亡率為12.5%(9/72)。

2 顱腦損傷后2d，各損傷組較假手術組的腦組織含水量均明顯增加(P＜0.05)。與假手術組相比，單純創傷組和傷后6h給藥組的增幅最大，分別為7.78%和6.47%(P＜0.05)，后兩者之間差異無統計學意義(P＞0.05)。傷前6h給藥組和創傷即刻給藥組增幅較小，分別為2.95%和3.07%，兩者間差異無統計學意義(見表1)。另外，給予AQP4 siRNA組大鼠于傷后3、5、7d，腦組織含水量較單純創傷組均顯著降低(未加入數據)。

表1 顱腦損傷2d后各實驗組大鼠腦組織含水量(%，n=6，±s)

表1 顱腦損傷2d后各實驗組大鼠腦組織含水量(%，n=6，±s)

與假手術組比較:●P＜0.05;與單純創傷組比較:▲P＞0.05，■P＜0.05

實驗分組 損傷側(左側)含水量假手術組76.83±0.51單純創傷組 82.81±0.86●傷前6h給藥組 79.10±0.67●■創傷即刻給藥組 79.19±0.70●■傷后6h給藥組 81.80±0.96●▲

3 顱腦損傷2d后，各損傷組單位質量腦組織EB含量明顯(P＜0.05)增加。與假手術組相比，單純創傷組、創傷即刻給藥組和傷后6h給藥組增幅較大，分別為288.83%和243.63%和272.34%;傷前6h給藥組增幅最小，為104.91%(見圖1)。

圖1 顱腦損傷2d后各組大鼠單位質量腦組織EB含量(μg)

4 顱腦創傷2d后，傷前6h給藥組和創傷即刻給藥組的星形膠質細胞和神經元水腫的范圍和程度明顯低于傷后6h給藥組。假手術組未見水腫跡象，單純創傷組水腫程度和范圍最嚴重(圖2)。

圖2 A～C為單純創傷組TBI2d后，損傷中心腦組織HE染色，D為空白對照組相同位置HE染色。A.星形膠質細胞和神經元細胞水腫明顯，細胞質和細胞核染色變淡，損傷周圍皮質可見血細胞;B.損傷中心可見到明顯的膠質細胞增生，神經元數目減少;C.神經元變性、萎縮，細胞間隙增寬，微血管內皮細胞腫脹;D.未見明顯細胞水腫和變性

5 顱腦損傷后2d，單純創傷組較假手術組的AQP4蛋白平均陽性細胞面積明顯升高(P＜0.05)，傷前6h給藥組、創傷即刻給藥組和傷后6h給藥組較假手術組的AQP4蛋白平均陽性細胞面積明顯下降，降幅分別為78.63%，81.91%和73.37%(P＜0.05)(見圖3);顱腦損傷后2d，單純創傷組較假手術組的AQP4mRNA平均陽性細胞面積顯著升高(P＜0.05)，傷前6h給藥組、創傷即刻給藥組和傷后6h給藥組較假手術組降幅分別為82.93%，78.46%和65.09%(P＜0.05)(見圖4)。

圖3 顱腦損傷后2d，各組大鼠腦內AQP4免疫熒光組織化學染色(×400)。A.假手術組;B.單純創傷組;C.傷前6h給藥組;D.創傷即刻給藥組;E.傷后6h給藥組?？梢夿組陽性細胞數量和熒光強度較其他4組明顯升高。C、D和E組陽性細胞較A組明顯減少，說明藥物在2d后，仍有較高水平的沉默效率，其中，C、D和E組的陽性細胞數量無明顯差異

圖4 顱腦損傷后2d，AQP4mRNA平均陽性細胞面積(μm2)

6 顱腦損傷后2d，各損傷組腦內MMP9含量均明顯(P＜0.05)升高。單純創傷組、創傷即刻給藥組和傷后6h給藥組增幅最大，分別為371.10%，306.58%和347.12%(P＜0.01);傷前6h給藥組增幅最小，為136.71%(P＜0.05)(見圖5和表2)。

圖5 顱腦損傷后2d，各組大鼠腦內MMP9免疫組織化學染色(×400)。陽性細胞內的陽性表達境界清楚，呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于細胞質內，有的細胞突起內也有表達。A.假手術組;B.單純創傷組;C.傷前給藥組;D.創傷即刻給藥組;E.傷后給藥組

表2 各組大鼠腦內MMP9平均陽性細胞面積(μm2，n=6，±s)

表2 各組大鼠腦內MMP9平均陽性細胞面積(μm2，n=6，±s)

與假手術組比較:▲P＜0.05，■P＜0.05;與單純創傷組比較:▲P＜0.05

實驗分組 MMP9平均陽性細胞面積假手術組7.30±0.27單純創傷組 34.39±3.71■傷前6h給藥組 17.28±4.05▲創傷即刻給藥組 29.68±4.87■傷后6h給藥組 32.64±5.50■

7 顱腦損傷2d后，各損傷組腦組織中ZO-1蛋白的含量均明顯下降(P＜0.05)。單純創傷組、創傷即刻給藥組和傷后6h給藥組降幅較大，分別為55.51%，47.59%和52.29%;傷前6h給藥組降幅較小，為23.07%(P＜0.05)。傷前6h給藥組較其他創傷組差異有統計學意義(P＜0.05)(見圖6和表3)。

圖6 顱腦損傷后2d，各組大鼠腦內ZO-1免疫組織化學染色，條索狀褐色影為陽性表達。A.假手術組;B.單純創傷組;C.傷前6h給藥組;D.創傷即刻給藥組;E.傷后6h給藥組

表3 各組大鼠腦內ZO-1平均陽性面積(μm2，n=6，±s)

表3 各組大鼠腦內ZO-1平均陽性面積(μm2，n=6，±s)

與假手術組比較:▲P＜0.05，■P＜0.05;與傷前6h給藥組比較:▲P＜0.05

實驗分組 ZO-1平均陽性表達面積假手術組24.23±3.72單純創傷組 10.78±4.63▲傷前6h給藥組 18.64±5.18■創傷即刻給藥組 12.70±4.91▲傷后6h給藥組 11.56±4.88▲

討 論

1 AQP4與早期腦水腫

AQP4蛋白是膠質細胞、腦脊液以及血管之間相互調節和運輸水分的重要結構基礎［5］，而且，水通道蛋白可以使水分子順滲透壓梯度雙向轉運［6］。Klatzo［7］將腦水腫分為血管源性腦水腫和細胞毒性腦水腫兩類。研究證實，腦損傷后大量水分通過AQP4進入腦內，導致了細胞毒性腦水腫的形成;AQP4同時能夠促進血管源性腦水腫時過多水的再吸收，易于腦內多余水分清除，從而減輕血管源性腦水腫［8－9］，可見同為腦水腫，由于形成機制的不同，AQP4所起的作用相反。

研究發現，大鼠外傷后1、4h腦內AQP4表達無變化［10］，至外傷后6h，AQP4的含量有統計學意義增加［11］。局灶性腦挫裂傷后1～2d，為損傷側腦組織含水量的高峰期［12］。實驗證明，利用化學合成法合成的AQP4小干擾RNA可以在腦室給藥6h內顯著降低腦內AQP4蛋白和mRNA的含量。本實驗于傷前6h、傷后0h、6h給予AQP4siRNA，分別可以自傷后0h、6h、12h起有效沉默AQP4表達，并可以觀察不同處理組間對創傷性腦水腫的影響。

傷前6h給藥時，觀測發現腦組織含水量和BBB通透性較單純創傷組均顯著降低，說明這一時期以細胞毒性腦水腫為主。本實驗中，創傷即刻給藥組在傷后6h內抑制AQP4蛋白，傷后2d腦組織含水量明顯改善，但是BBB通透性未見明顯改善，說明血管內皮存在損傷，血管源性腦水腫仍然存在。本實驗傷后6h給藥組中，在傷后12h充分抑制AQP4蛋白，傷后2d腦組織含水量和BBB通透性均顯著升高，較單純創傷組未見明顯差異。說明創傷發生12h以后抑制AQP4蛋白，無法有效改善腦組織含水量，這一時期以血管源性腦水腫為主。

2 AQP4與ZO-1、MMP9

在病理情況下，BBB連接復合體結構的破壞和功能改變，引起BBB調控失代償，并最終導致腦損傷。ZO-1是緊密連接蛋白的重要構成部分，其表達水平的下降可以作為BBB破壞的標志［13］。AQP4和MMP9是腦水腫和BBB機能障礙病理機制必不可少的組成部分［14］。本實驗創傷即刻給藥組、傷后6h給藥組和單純創傷組較傷前6h給藥組的MMP9含量均明顯升高，而ZO-1含量均明顯降低。前三組間MMP9和ZO－1含量無明顯差異。說明抑制AQP4無法影響MMP9和ZO-1含量，AQP4與后兩種蛋白無直接關聯。

總之，目前創傷性腦水腫早期的治療仍然很大程度上依靠滲透性藥物和外科手術治療，以相關蛋白為靶點的藥物治療常常被人們忽視。頭部撞擊傷后，對于AQP4蛋白進行激活還是抑制取決于腦水腫的形成和清除機制，也就是該腦水腫是血管源性腦水腫還是細胞毒性腦水腫占主導地位。本實驗通過不同時期抑制AQP4蛋白，發現局灶性腦挫裂傷后0～6h沉默AQP4蛋白表達，能夠有效抑制傷后早期腦組織含水量，但是無法有效降低BBB的通透性，此時期以細胞毒性腦水腫為主導;傷后7～12h沉默AQP4蛋白，無法有效抑制早期腦水腫和降低BBB的通透性，說明此時期以血管源性腦水腫為主導。

顱腦創傷前抑制AQP4蛋白，可明顯抑制早期腦水腫。傷后初期(6h內)抑制AQP4蛋白，可明顯抑制傷后腦水腫，但無法改善傷后BBB通透性。傷后6～12h抑制AQP4蛋白無法抑制腦水腫和改善BBB的通透性。

［1］Cahill J，Zhang JH.Subarachnoid hemorrhage:is it time for a new direction［J］.Stroke，2009，40(2):86－87.

［2］Papadopoulos MC，Verkman AS.Aquaporin－4 and brain edema［J］.Pediatr Nephrol，2007，22(6):778－862.

［3］King LS，Nielsen S，Agre P.Respiratory aquaporins in lung inflammation:the night is young［J］.Am J Respire Cell Molboil，2000，22(1):8－10.

［4］Nicchia GP，Srinivas M，Li W，et al.New possible roles for aquaporin－4 in astrocytes:cell cytoskeleton and functional relationship with connexin43［J］.FASEB，2005，19(7):1674－1676.

［5］Badaut J，Lasbenns F，Magistretti PJ，et al.Aquaporins in brain:distribution，physiologt and pathophysiology［J］.Cereb Blood Flow Metab，2002，22(3):367－378.

［6］Zhao J，Moore AN，Clifton GL，et al.Sulforaphane enhances aquaporin－4 expression and decreases cerebral edema following traumatic brain injury［J］.Neurosci Res，2005，82(4):499－506.

［7］Klatzo I.Evolution of understanding concepts of brain edema［M］.The 9th international symosium on brain edema(Abstrast book)，1993:1.

［8］Papadopoulos MC，Manley GT，Krishna S，et al.Aquaporin－4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema［J］.FASEB，2004，18(2):1291－1293.

［9］Nag S，Manias JL，Stewart DJ.Pathology and new players in the pathogenesis of brain oedema［J］.Acta Neuropathol，2009，118(5):197－217.

［10］Sun MC，Honey CR，Berk C，et al.Regulation of aquaporin－4 in a traumatic brain injury model in rat［J］.J Neurosurg，2003，98(3):565－574.

［11］張琳，袁芳.大鼠腦外傷誘導水通道蛋白4表達增強加重腦水腫［J］.首都醫科大學學報，2008，29(12):732－736.

［12］Kiening KL，van Landeghem TK，Schreiber S，et al.Decreased hemispheric Aquaporin－4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats［J］.J Neurosci Lett，2002，324(9):105－108.

［13］Kirk J，Plumb J，Mirakhur M，et al.Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood－brain barrier leakage and active demyelination［J］.J Pathol，2003，201(2):319.

［14］Higashida T，Kreipke CW，Rafols JA，et al.The role of hypoxia-inducible factor-1α，aquaporin-4，and matrix metalloproteinase-9 in blood-brain barrier disruption and brain edema after traumatic brain injury［J］.J Neurosurg，2011，114(11):92-101.