大黃素甲醚聯合臍帶間充質干細胞移植對創傷性腦損傷大鼠MMP-9和TIMP-1蛋白酶的影響

李長棟，荔志云，白 海，孫建軍，趙 強

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是頭部受到暴力所造成的損傷，無論在平時或戰時，其發生率僅次于四肢傷，但在死亡傷員中占第一位，是死亡率最高的部位傷，一直是戰創傷救治的重點和難點。重型顱腦損傷所導致的重度殘疾和持續性植物狀態的有效治療也一直是困擾臨床醫生和科研工作者的難題［1］。

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)是一種來源于中胚層具有自我復制更新和多向分化的成體多能干細胞［2］。干細胞移植作為一項治療TBI新的手段近年來得到人們認同［3］。其可通過多種途徑對腦損傷后血腦屏障破壞起著保護和修復受損神經細胞的作用［4］。大黃素甲醚(physcion)為大黃中有效成分之一，文獻報道大黃素甲醚具有皮層神經元神經營養作用［5］、抗神經細胞凋亡作用［6］、抗炎性因子和抗氧化作用［7］等。中藥對TBI后的神經保護作用已有報道。前期研究表明，大黃素甲醚聯合HUCMSCs對腦損傷具有明顯保護作用。本研究運用ELISA法，從腦組織微血管基質金屬蛋白酶的表達變化方面，動態觀察HUC-MSCs移植對腦損傷血腦屏障的保護作用，從其對基質金屬蛋白酶變化的影響方面進一步探討其可能的作用機制。

材料與方法

1 實驗動物

Wistat大鼠:體質量200～250g，2～3月齡，雌雄不限;由蘭州軍區蘭州總醫院實驗動物中心提供。

2 主要儀器和試劑

人臍帶間充質干細胞(蘭州軍區蘭州總醫院血液病干細胞治療中心培養);DAPI工作液(美國Sigma公司);低溫高速臺式離心機(UNIVERSAL116型，德國Hetaeus公司):倒置相差顯微鏡(CKX41-A32PH型，日本Olympus公司);細胞培養箱(NU-2700E型，德國NUAIR公司);潔凈工作臺(SW-CJ-2FD型，蘇州潔凈化設備有限公司);微量移液器(大龍醫療設備上海有限公司):水欲搖床(SBD50-1.610型，Heto公司);恒溫循環器(CBN8-30型，Heto公司);－80℃超低溫冰箱(MDF-381型，日本三洋有限公司);－20℃冰箱(BCD-218型，蘭州長風機器廠):電子天平(AG-135型，瑞士梅特勒公司);流式細胞檢測儀(E0675型，美國FACSCALIBUR公司);正置萬能顯微鏡［20050929(ND-11D)，日本Olympus公司］;LG-DMEM基礎培養基(購于美國Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(購于浙江天杭生物科技有限公司);胰蛋白酶(購于美國Amresco公司);抗體FITC-CD44、PE-CD45、PE-CD34(美國BD公司);大黃素甲醚(陜西信瑞生物科技有限公司，生產批號:SR-20100902);ELISA試劑盒(上海博邁生物科技有限公司)，金屬蛋白酶-9及金屬蛋白酶組織抑制因子-1(上海博邁生物科技有限公司)。

3 TBI動物模型的建立與實驗步驟

將40只大鼠隨機分為對照組(10只)、TBI組(10只)、HUC-MSCs移植組(10只)、HUC-MSCs移植+大黃素甲醚組(10只)。對TBI組(10只)、HUC-MSCs移植組(10只)、HUC-MSCs移植+大黃素甲醚組(10只)大鼠進行TBI模型制備，體積分數為10%水合氯醛按3ml/kg體重腹腔麻醉后，采用改良Feeney法建立自由落體撞擊造成閉合性顱腦損傷(一根長50cm、直徑2.5cm的鋼管和重500g的天平砝碼)，致傷后大鼠出現四肢抽搐，呼吸暫停數秒，術后昏迷時間2～10h說明致傷成功。HUCMSCs移植組、聯合組20只大鼠在制模結束24h后，將HUC-MSCs 2.0×106個細胞懸液0.5ml通過大鼠尾靜脈植入。聯合組大鼠在移植細胞2～4h開始予大黃素甲醚干預，用藥劑量40mg/(kg·d)灌胃，共用藥2周。

4 臍帶間充質干細胞的培養、鑒定

本實驗模仿齊凱等［8］的方法進行臍帶間充質干細胞的培養、分離和純化。取對數期P3代細胞，0.25%胰蛋白酶消化，配制成濃度為10×106/ml的細胞懸液，每個Eppendorf管加100μl的細胞懸液，每種抗體設置2個復管，分別加入20μlFITC-CD44、PE-CD45、PE-CD34，對照管分別加入等量相對應的FITC-IgG1和PE-IgG1，冰上避光孵育30min，PBS洗滌2次，250g離心5min，重新制備細胞懸液，經400目細胞篩過6濾，流式細胞儀(FACSCalibur)上機檢測，FACS分析，記數10細胞，CellQuest軟件分析結果。

5 取材與處理

對照組和TBI組大鼠在模型制備48h、14d、21d、28d后分批取腦;HUC-MSCs移植組、HUCMSCs移植+大黃素甲醚組大鼠在細胞移植21d斷頭取腦，將標本分為2份。一份用于HE染色病理學觀察(各組自前囟處開始作冠狀位切片，隔5取1，至海馬結構行蘇木精-伊紅染色，每個腦標本選取海馬相同位置非連續層面5處，每一層面處連續切片3張);一份將腦組織使用勻漿器勻漿后取上清液用于ELISA法檢測。

6 統計學處理

結 果

HUC-MSCs流式細胞學檢測細胞表面抗原發現，MSC的標志抗原CD45表達陽性，白細胞標志抗原CD44和造血前體細胞標志抗原CD34均表達陰性，證實該細胞為臍帶間充質干細胞(圖1)。

對照組大鼠腦組織中MMP-9表達較強，模型組較對照組減弱(P＞0.05)。與TBI模型組比較，HUC-MSCs移植組和HUC-MSCs移植組+大黃素甲醚組大鼠腦組織中MMP-9表達減弱(P＜0.01)。對照組大鼠腦組織中TIMP-1表達明顯，模型組大鼠腦組織中TIMP-1表達減弱(P＜0.01)。HUC-MSCs移植組和HUC-MSCs移植組+大黃素甲醚組大鼠腦組織中TIMP-1表達均較TBI模型組增強(P＜0.01)，結果見表1。

圖1 HUC-MSCs表達CD44，純度可達99%以上，不表達造血干細胞表型CD34和CD45

表1 各組大鼠腦組織中TIMP-1和MMP-9表達(±s，OD×10－2)

表1 各組大鼠腦組織中TIMP-1和MMP-9表達(±s，OD×10－2)

與對照組比較:△P＜0.01，#P＜0.01;與TBI模型組比較:#P＜0.01;與HUC-MSCs移植組比較:△P＜0.05;TBI組于對照組比較:◆P＞0.05，*P＜0.01

組別 n MMP-9陽性表達TIMP-1陽性表達正常對照組6 36.81±0.04 66.85±0.04 TBI模型組 6 35.81±0.02◆ 42.95±0.05*HUC-MSCs移植組6 22.95±0.02# 47.01±0.05#HUC-MSCs移植組+6 23.53±0.03△ 44.78±0.05△大黃素甲醚組

討 論

大黃是一味應用廣泛的傳統中藥，主要藥理作用包括:致瀉、保肝、止血、利尿、抗炎，抑制細胞凋亡等［9－11］。大黃素甲醚(physcion)為大黃中有效成分之一，具有皮層神經元神經營養作用［12］、抗神經細胞凋亡作用［13］、抗炎性因子和抗氧化作用［14］等。TBI后繼發性缺血再灌注損傷可引起血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞，導致腦部毛細血管通透性的增加，加重腦水腫［15］。BBB對于維持中樞神經系統內環境的穩定具有非常重要的意義。對于BBB損傷的機制很多，其中原因之一為基質金屬酶對毛細血管基底膜的降解［16］。創傷性腦損傷可激活MMP-9降解為細胞外成分，引起BBB的破壞，MMP-9為血管源性水腫和繼發性腦損傷的重要因素［17］;TIMP-1是MMP-9的天然特異性抑制劑，在腦損傷中TIMP-1的作用主要是與MMP-9特異性結合，其中TIMP-1可選擇性抑制MMP-9，阻斷MMP-9對細胞外基質的降解。腦損傷可激活MMP-9，引起MMP-9和TIMP-1失衡，造成血腦屏障破壞［18］。因此，腦損傷后通過調節明膠酶系統失衡可發揮血腦屏障保護作用。其作用機制可能為:(1)通過抑制AQP-4基因轉錄和翻譯，改善血腦屏障損傷減輕腦水腫的作用;(2)增加基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)表達以調節基質金屬蛋白酶(MMP-9)平衡，可使腦缺血再灌注損傷大鼠微血管基底膜Ⅳ型膠原(typeⅣcollagen，colⅣ)降解減少，通透性降低，減輕腦水腫，發揮腦保護作用。

本研究顯示，TBI后MMP-9表達明顯增強，HUC-MSCs移植可明顯減弱腦組織MMP-9、增強TIMP-1表達;大黃素甲醚+HUC-MSCs移植組大鼠腦內TIMP-1表達顯著增強，認為大黃素甲醚可能是通過上調HUC-MSCs移植后TIMP-1水平以調節基質金屬蛋白酶失衡，進而減輕微血管基底膜膠原降解以發揮對血腦屏障保護的促進作用。

［1］Yu F，Morshead CM.Adult stem cells and bioengineering strategies for the treatment of cerebral ischemic stroke［J］.Curr Stem Cell Res Ther，2011，6(3):190－207.

［2］哈承志，王大偉.臍帶間充質干細胞在骨組織工程中的應用進展［J］.中國組織工程研究，2012，16(1):158－162.

［3］Ding DC，Shyu WC，Lin SZ.Mesenchymal stem cells［J］.Cell Transplant，2011，20(1):5－14.

［4］Pelosi E，Castelli G，Testa U.Human umbilical cord is a unique and safe source of various types of stem cells suitable for treatment of hematological diseases and for regenerative medicine［J］.Blood Cells Mol Dis，2012，49(1):20－28.

［5］蘇鉅年，賴永長，皮婷，等.大黃素甲醚對體外新生大鼠皮質神經元的營養作用［J］.中成藥，2011，33(10):1790－1793.

［6］張明，荔志云，趙紅斌，等.大黃素甲醚對神經細胞缺氧性損傷保護作用的實驗研究［J］.西北國防醫學雜志，2012，33(2):106－110.

［7］Ma BL，Ma YM，Yan DM，et al.Effective constituents in Xiexin Decoction for anti－inflammation［J］.J Ethnopharmacol，2009，125(1):151－156.

［8］齊凱，董麗媛，陳顯久，等.人臍帶來源間充質干細胞分離培養方法的優化［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(23):4220－4224.

［9］Sheng X，Wang M，Lu M，et al.Rhein ameliorates fatty liver disease through negative energy balance，hepatic lipogenic regulation，and immunomodulation in diet－induced obese mice［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，3(3):886－893.

［10］Rajkumar V，Guha G，Ashok Kumar R.Antioxidant and anti－cancer potentials of rheum emodi rhizome extracts［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2011，697986.

［11］Chang MH，Chang SC，Chan WH.Injurious effects of emodin on maturation of mouse oocytes，fertilization and fetal development via apoptosis［J］.Int J Mol Sci，2012，13(11):13911－13925.

［12］Yang EJ，Min JS，Ku HY，et al.Isoliquiritigenin isolated from Glycyrrhiza uralensis protects neuronal cells against glutamate－induced mitochondrial dysfunction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，421(4):658－664.

［13］Hwang C，Kchun HS.Isoliquiritigenin isolated from licorice Glycyrrhiza uralensis prevents 6－hydroxydopamine－induced apoptosis in dopaminergic neurons［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2012，76(3):536－543.

［14］Cho N，Choi JH，Yang H，et al.Neuroprotective and antiinflammatory effects of flavonoids isolated from Rhus verniciflua in neuronal HT22 and microglial BV2 cell lines［J］.Food Chem Toxicol，2012，50(6):1940－1945.

［15］Shin JW，Kang HC，Shim J，et al.Scutellaria baicalensis attenuates blood－brain barrier disruption after intracerebral hemorrhage in rats［J］.Am J Chin Med，2012，40(1):85－96.

［16］Barr TL，Latour LL，Lee KY，et al.Blood－brain barrier disruption in humans is independently associated with increased matrix metalloproteinase－9［J］.J Cereb Circulation，2010，41(3):123－128.

［17］Hosokawa T，Nakajima H，Doi Y，et al.Increased serum matrix metalloproteinase－9 in neuromyelitis optica:implication of disruption of blood－brainbarrier［J］.J Neuroimmunol，2011，(6):81－86.

［18］Ralay Ranaivo H，Hodge JN，Choi N，et al.Albumin induces upregulation of matrix metalloproteinase－9 in astrocytes via MAPK and reactive oxygen species－dependent pathways［J］.J Neuroinflamm，2012，(9):67－68.