高聚物萃取分光光度法測定茶多酚含量的研究

杜建中，姚 媛，文超燕

（湛江師范學院化學科學與技術學院，廣東湛江524048）

茶多酚屬于多酚類物質，是茶葉中含有2-苯基苯并吡喃的衍生物的多酚類物質的總稱，因其分子結構中含有較多的還原性酚羥基而具有很強的清除體內自由基的功能，是一種純天然的抗氧化劑，具有優越的抗氧化能力，并具有抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、降血糖、降血壓、降血脂及殺菌等一系列藥理功能，在油脂、食品、醫藥、日化、化妝品、保健品及飲料等領域具有廣泛的應用前景[1-3]。我國衛生部已批準了茶多酚天然抗氧化劑為我國的食品添加劑之一。茶飲料因風味獨特，兼有營養、保健功效，是清涼解渴、深受消費者歡迎的多功能飲料。因此，茶多酚含量的高低是評價茶飲料質量的一個主要指標。茶多酚含量的測定方法主要有氧化還原滴定法[4]、可見分光光度法[5-7]、差示分光光度法[8]、三波長分光光度法[9]、重氮化-偶合分光光度法[10]紫外分光光度法[11]、流動注射法[12-14]、離子電極法[15]、電化學法[16]、原子吸收法[17]、高效液相色譜法[18]等。根據茶飲料的組成特點，本實驗采用高聚物水溶液對茶飲料中的茶多酚進行了定量萃取，并利用分光光度法對茶多酚含量進行了定量測定，取得了較滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沒食子酸丙酯 國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷 珠海市華成達化工有限公司；酒石酸鉀鈉 天津市大茂化學試劑廠；硫酸亞鐵 天津市致遠化學試劑有限公司；聚乙二醇-4000 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨 天津市大茂化學試劑廠；所有實驗用水 均為去離子水；試劑 均為分析純；勁涼冰紅茶、檸檬茶、綠茶、冰醇茉莉、冰紅茶 市售。

UV-2550紫外可見分光光度計 日本島津制作所；精密pH計 廣州廣一科學儀器有限公司；分析天平 上海濟成分析儀器有限公司；DT100電子天平常熟市雙杰測試儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 沒食子酸丙酯標準儲備液：準確稱取0.250g沒食子酸丙酯，用水溶解后定容至250mL，其濃度為4.71mmol·L-1，實驗時稀釋至0.471mmol·L-1；酒石酸亞鐵溶液：稱取七水合硫酸亞鐵0.1g，四水合酒石酸鉀鈉0.5g，溶于水并稀釋至100mL（避光，現配現用）；300g·L-1的聚乙二醇-4000溶液：稱取150g聚乙二醇-4000，溶解、稀釋至500mL，移至棕色瓶避光保存；0.2mol·L-1三羥甲基氨基甲烷溶液：稱取4.8g三羥甲基氨基甲烷，加水溶解至200mL，實驗時，調至所需pH。

1.2.2 吸收曲線的繪制 準確移取10.00mL 0.471mmol·L-1的沒食子酸丙酯標準溶液置于60mL的分液漏斗中，加入5.0mL 300g·L-1聚乙二醇-4000，搖勻后加入4.0g（NH4）2SO4固體，振蕩2min，靜置。待兩相分層清楚后，棄去下層水相，將上層高聚物相轉移至25mL容量瓶中，潤洗分液漏斗3次，洗液并入容量瓶中。加入5.0mL pH8.0三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液，5.0mL酒石酸亞鐵溶液，定容，搖勻。10min后，以未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白為參比溶液，400～800nm范圍進行波長掃描，繪制吸收曲線。

1.2.3 緩沖溶液的選擇 準確移取10.00mL 0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液于4個分液漏斗中，按照“1.2.2”操作萃取分離。分別加入pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液、硼砂緩沖溶液、三乙醇胺緩沖溶液、三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液，5.0mL酒石酸亞鐵溶液，定容，搖勻。

1.2.4 緩沖溶液的pH的影響 準確移取10.00mL 0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液于8個分液漏斗中，按照“1.2.2”操作萃取分離。分別加入5.0mL pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液，5.0mL酒石酸亞鐵溶液，定容，搖勻。分別以pH為7.0、8.0、8.5、9.0的未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白為參比溶液，在518nm測定其吸光度值。

1.2.5 緩沖溶液用量的影響 準確移取10.00mL 0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液于分液漏斗中，按照“1.2.2”操作萃取分離后，分別加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，酒石酸亞鐵溶液5.0mL，定容，搖勻。在518nm分別測定其吸光度。

1.2.6 顯色液用量的影響 準確移取0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液10.00mL，按照“1.2.2”操作萃取分離。加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液2.0mL，分別加入酒石酸亞鐵溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、9.0mL，定容，搖勻。以未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白為參比溶液，在518nm分別測定其吸光度。

1.2.7 顯色時間的確定 準確移取0.471mmol·L-1的沒食子酸丙酯標準溶液10.00mL，按照“1.2.2”操作萃取分離。加入酒石酸亞鐵溶液3.0mL，pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液2.0mL，定容，搖勻。以未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白為參比溶液，在518nm測定顯色時間為2、5、7.5、10、15、20、25min時溶液的吸光度。

1.2.8 萃取率的測定 為了解聚乙二醇-4000對茶飲料中茶多酚的萃取效率，移取茶飲料5.00mL于60mL分液漏斗中，加入300g·L-1聚乙二醇-4000溶液5.0mL，搖勻后加入4.0g（NH4）2SO4固體，振蕩2min，靜置。待兩相分層后，將萃余水相轉移至25mL容量瓶中，加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液2.0mL，酒石酸亞鐵溶液3.0mL，定容，搖勻。10min后，以未加茶飲料的萃余水相的試劑空白為參比溶液，在400～800nm范圍掃描其吸收曲線。

1.2.9 標準曲線的繪制 分別準確移取不同體積的0.471mmol·L-1沒食子酸丙酯標準溶液于60mL的分液漏斗中，加水至約10mL，加入5.0mL 300g·L-1聚乙二醇-4000，搖勻后加入4.0g（NH4）2SO4固體，振蕩2min，靜置。待兩相分層清楚后，棄去下層水相，將上層高聚物相轉移至25mL容量瓶中，潤洗分液漏斗3次，洗液并入容量瓶中，加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液2.0mL，酒石酸亞鐵溶液3.0mL，定容，搖勻，配制成沒食子酸丙酯系列標準顯色溶液。10min后，用1cm比色皿，以未加沒食子酸丙酯的高聚物萃取相的試劑空白作為參比，在518nm處測定吸光度，繪制吸收曲線。

1.2.10 樣品的測定 準確移取4.00mL待測樣品液于60mL分液漏斗中，按“1.2.2”步驟操作萃取分離。加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液2.0mL，酒石酸亞鐵溶液3.0mL，定容，搖勻，在518nm處測定吸光度。代入線性方程，計算溶液中茶多酚的濃度，并求出樣品中茶多酚的含量。

1.2.11 茶多酚質量濃度的計算 換算公式如下：

式中，C為根據溶液吸光度測得樣品中茶多酚的物質的量濃度；V為樣品體積（1升），M沒食子酸丙酯為沒食子酸丙酯的摩爾質量；1.5為換算因子。

2 結果與討論

2.1 測定條件的確定

2.1.1 測定波長的確定 由吸收曲線可知，在pH8.0的三羥甲基氨基甲烷溶液中，沒食子酸丙酯與酒石酸亞鐵形成的絡合物在518nm處有最大吸收，故選擇518nm為實驗的測定波長。

圖1 吸收曲線Fig.1 Absorption curve

2.1.2 緩沖溶液的確定 磷酸鹽、硼砂會使有機相產生渾濁，對檢測不利；三乙醇胺能與沒食子酸丙酯產生顏色反應，生成桃紅色物質，對實驗的檢測產生影響；三羥甲基氨基甲烷無任何肉眼可見的不良現象，故選擇其為緩沖溶液。

圖2 緩沖溶液pH影響Fig.2 Effect of pH of the buffer solutions

2.1.3 緩沖溶液的pH及其用量確定 酸度對顯色反應的影響很大，溶液酸度直接影響著金屬離子、顯色劑的存在形式和有色絡合物的組成、穩定性等。很多顯色劑本身就是酸堿指示劑，酸度不同時，它們的顏色不同，可能造成顯示劑顏色與絡合物的顏色相近而影響測定。由圖2可知，在其他條件相同的情況下，沒食子酸丙酯與酒石酸亞鐵形成的絡合物在pH7.5～8.5時吸光度最大，故實驗選擇三羥甲基氨基甲烷溶液pH為8.0。由圖3可知，在實驗條件下，三甲羥基甲氨基烷溶液用量在1mL以上時，溶液的吸光度基本不變，為保證溶液有足夠的緩沖能力，實驗選擇三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液用量為2.0mL。

圖3 緩沖溶液用量的影響Fig.3 Effect of the buffer solutions

2.1.4 顯色劑用量及顯色時間的確定 為保證顯色反應進行完全，加入過量的顯色劑是必要的，但過多的顯色劑不僅會造成試劑的浪費，還可能影響顯色效果。由圖4可知，加入酒石酸亞鐵溶液在2.0～3.5mL時，溶液的吸光度最大，實驗選擇酒石酸亞鐵溶液用量為3.0mL。在顯色反應中，時間包括兩個含義，顯色時間和穩定時間，顯示時間太短顯色反應可能不完全，顯示時間太長造成實驗用時延長。由圖5可知，本實驗顯色時間8min以后，溶液的吸光度基本穩定不變，實驗選擇顯示反應時間10min。

圖4 顯色劑用量的影響Fig.4 Effect of color reagent

圖5 顯色時間的影響Fig.5 Effect of color reaction times

2.2 萃取率的測定

實驗重要環節之一是將茶飲料中的茶多酚萃取至高聚物相，萃取效率的高低對測定結果有很大的影響，通過在萃余水相加入pH8.0三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液和酒石酸亞鐵溶液后，觀察其顯色情況，若萃余水相中含有茶多酚，酒石酸亞鐵將與茶多酚發生顯色反應，在測定波長下產生吸收，萃余水相中茶多酚含量越高吸收越大，利用萃余水相的吸收曲線可判斷萃取效率的高低。由圖6可知，茶飲料的萃余水相中加入酒石酸亞鐵，在400～700nm波長范圍沒有吸收，說明茶飲料中的茶多酚已全部轉移至聚乙二醇-4000相。

圖6 萃余水相的吸收曲線Fig.6 Absorption curve of aqueous phase

2.3 標準曲線的繪制

測定出系列標準溶液的吸光度，以吸光度A為縱坐標，沒食子酸丙酯的濃度C（mmol·L-1）為橫坐標繪制標準曲線，見圖7，其線性方程為：A=3.1106C-0.0056，R2=0.9999。進一步實驗，沒食子酸丙酯在0.004～0.4mmol·L-1濃度范圍內，具有良好的線性關系。

2.4 樣品測定及精密度實驗

對市場上銷售的5種茶飲料，按“1.2.10”方法平行測定5次，測定結果見表1。

相對標準偏差數據顯示，該方法測定的數據具有較高的精密度，RSD范圍為1.0%～3.2%。

表1 樣品測定及精密度實驗（n=5）Table 1 Determination of the samples and test of precision（n=5）

表2 樣品回收率實驗（n=5）Table 2 Rate of recovery results（n=5）

圖7 標準曲線Fig.7 Standard curve

2.5 回收實驗

分別準確移取勁涼冰紅茶和冰醇茉莉4.00mL各5份于60mL的分液漏斗中，加入一定量沒食子酸丙酯標準溶液，加水至10mL，按“1.2.10”操作，測定吸光度，作加標回收實驗，其回收率在92.4%～103.5%，說明方法具有較高的準確度。結果見表2。

3 結論

實驗證明，利用水溶性高聚物可將茶飲料中的茶多酚全部轉移至聚乙二醇-4000相中，達到了從茶飲料中定量提取茶多酚，減少茶飲料中其他成分對茶多酚測定干擾的目的。在pH8.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，以酒石酸亞鐵為顯色劑，利用分光光度法實現了對茶飲料中茶多酚含量的定量測定。該方法操作簡單方便，方法可靠，準確度較高，且使用的萃取劑無毒、不揮發，避免了使用有機溶劑為萃取劑進行操作時對實驗者身心健康的傷害，為茶飲料中茶多酚的定量測定提供了較理想的分析方法。

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