E R I C-P C R技術對單增李斯特菌的溯源分析

劉海泉，朱 穎，姜文潔，孫曉紅，吳啟華，潘迎捷，趙 勇，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海201306；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306；4.美國緬因大學食品科學與人類營養系，美國緬因州04469-5735）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種重要的食源性致病菌[1]，因感染后引起的李氏桿菌病死亡率約為20%～30%[2]。根據李斯特菌具有特定的表面蛋白，結合玻片凝集實驗，單增李斯特菌至少有13種血清型[3]。目前，單增李斯特菌流行病學調查的傳統方法多以血清分型、噬菌體分型等表型分析方法為主[4-6]，這些傳統的分型方法常常存在較高的誤差。分子分型是一種新興的流行病學調查手段，不僅克服了血清分型等傳統方法的不足，還能從遺傳學角度進行流行規律探討。其中，ERIC-PCR是基于“腸道細菌基因間重復序列”（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）具有分型率較高、準確性好、簡便快捷、無需特殊儀器等優點，首先在大腸桿菌中應用[7]；隨后擴展到其他人類病源菌，包括沙門氏菌[8-9]、副溶血性弧菌[10-12]等，以及動物及植物病原菌[13-15]。本研究采用ERIC-PCR法對從三個農貿市場豬肉樣品分離到的17株菌株進行了基因分型，并進行了多樣性分析，探討了基因型與區域性分布的關聯性，以期為單增李斯特菌的溯源和流行性分析提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 根據國家標準[16]從上海地區三個農貿市場的豬肉樣品中分離到17株單增李斯特菌菌株（表1），這些菌株分別從市場中不同攤位的樣品中分離出；單增李斯特菌ATCC 19115（簡寫為LM） 作為陽性對照；Taq DNA聚合酶、dNTP 大連TaKaRa公司；Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒 杭州Bioer公司；DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K 北京天根生化科技有限公司；李斯特菌選擇性增菌液（LB1）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA） 北京陸橋技術責任有限公司；李斯特菌選擇性瓊脂（PALCAM）、腦心浸液（BHI）、抗生素 英國OXOID公司；Milli-Q水。

表1 菌株來源及背景Table 1 Source and background of the strains

離心機、PCR儀、微量移液器 德國Eppendorf；電泳儀、凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌DNA提取 取于-80℃、25%甘油保存的菌種，接種于BHI肉湯在37℃下復蘇后，劃線接種于TSA瓊脂，挑取單菌落接種于營養肉湯中，在37℃下培養至對數期（OD600=0.8）。再劃線接種于PALCAM瓊脂上于37℃培養24h，連續活化2次。挑取單菌落，接種于LB1中，37℃ 170r/min振蕩培養，培養至OD600=0.8提取DNA[17]。使用Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒。按照說明書提取DNA。

1.2.2 PCR方法 ERIC-PCR引物參照Jersek等[18]的設計。正向引物Eric1R：ATGTAAGCTCCTGGGGATT CAC，反向引物Eric2：AAGTAAGTGACTGGGGTGAG CG，引物由上海生物工程技術有限公司合成。

PCR擴增體系溶液體積為25μL，其中ddH2O 16.2μL、10×緩沖液（+Mg2+）2.5μL、dNTPs（2.5mmol·L-1）2.0μL、引物10μmol·L-1各1μL、Taq酶（5U·μL-1）0.3μL、模板DNA 2.0μL。

PCR程序如下：95℃預變性2min；94℃ 30s，92℃30s，50℃ 30s，52℃ 1min，65℃8min，共循環35次；最后65℃維持8min。PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠120V電壓，電泳30min。

1.2.3 ERIC-PCR分型結果分析 經BioRad Molecular Imager? Gel Doc TM XR凝膠拍照后，使用自帶的ImageLab Version 3.0分析軟件中的“分析工具箱”-“泳帶和條帶”進行泳帶分析；采用“1”和“0”的方式記錄在Excel中，每個樣品的擴增帶存在時賦值為“1”，不存在時賦值為“0”。最后，通過NTsys 2.10e進行分析，得到Jaccard的遺傳相似性系數矩陣和遺傳距離矩陣，采用非加權配對法（UPGMA法）做遺傳分析的樹狀圖。凡相似度大于0.8者為同一亞型，小于0.8者為不同的基因型[19]

2 結果與討論

2.1 單增李斯特菌的ERIC-PCR分型

實驗結果表明，17株單增李斯特菌和質控菌株ATCC 19115（LM）經ERIC-PCR擴增，產生了12種不同的指紋圖，且指紋圖譜呈現出多態性（圖1）。PCR產物為3～8條，主帶為2條。

圖1 單增李斯特菌菌株ERIC-PCR指紋圖Fig.1 ERIC-PCR fingerprints of Listeria monocytogenes strains注：1.ATCC 19115；2～18，LM1～LM17。

2.2 單增李斯特菌ERIC-PCR指紋圖譜聚類分析

聚類分析結果表明，17株單增李斯特菌分為了至少6個基因類群，分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ及Ⅵ型（圖2）。其中Ⅳ型菌株最多，達11株；Ⅴ型略少，為2株；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅵ型最少，均只有1株，其中LM1與質控菌株ATCC 19115最近。

從圖2可以看出，菌株LM2、LM10、LM12和LM13，LM5和LM8，LM6和LM7可能為同一菌株。大部分菌株可能為LM9菌株的相似菌株，而菌株LM1與菌株LM16和LM17位于另外的分枝。菌株LM2、LM3、LM4、LM5、LM6、LM7、LM8、LM10、LM11、LM12和LM13為同一分支，說明它們可能為同類菌株，但來源不同，說明該類菌污染了多個不同樣品，是重要的污染食品的菌株類型；菌株LM12/LM13、LM14/LM15、LM16與LM17為同一批次、同一采集點、不同樣品分離到的，它們處于不同分支，說明它們不是同一菌株，這揭示在同一地點有可能污染多種單增李斯特菌。菌株LM1、菌株LM9、菌株LM14/LM15、LM16和LM17分別代表了不同菌株，而它們分別只在一個地點分離得到，說明它們是在本實驗采樣范圍內，污染食品較少的一株單增菌株。這17株菌株中至少包含了6種血清型。

圖2 17株單增李斯特菌指紋圖譜聚類分析圖Fig.2 Dendrogram based on UPGMA cluster analysis of ERIC-PCR data from 17 Listeria monocytogenes strains

此外，從不同地點分離到的單增李斯特菌呈現出不同的聚類特征。其中，市場3中分離出的菌株表現為最多的基因型類群，而市場1和2中分離到的基因型類群主要是Ⅰ和Ⅳ類群；Ⅳ類群是主要類群（圖3）。

通過分析可以發現ERIC-PCR基于基因組上的特定重復序列能夠很好把來源不同的單增李斯特菌菌株進行區分、歸類，進而達到溯源目的。

圖3 單增李斯特菌ERIC-PCR基因型類群與分離點間的關系Fig.3 Relationship between Listeria monocytogenes strains’sources and ERIC-PCR genotypes

單增李斯特菌是一種食源性、細胞內寄生致病菌，可引起嚴重的李氏桿菌病，已引起了公眾和食品安全專家的關注。由于其天然抗性，單增李斯特菌在自然界和食品加工廠中廣泛存在，99%的人類李氏桿菌病是因食用受污染的食品而引起[2，20]的。雖然單增李斯特菌不形成芽孢，它可以在食品加工環境中廣泛存在，并能堅持較長的時間，甚至數年之久[21]。單增李斯特菌已成為一個重大的公共衛生問題。由于單增李斯特菌菌株的毒力和致病性存在差異，具有多樣性[22]。而亞型分型可以準確、迅速地確定或追蹤單增李斯特菌單個菌株，這在控制和預防李氏桿菌病以及菌株的流行病學和群體遺傳學研究是必不可少的，這樣可以阻止李氏桿菌病的蔓延和減少不必要的食品召回。分子示蹤能夠準確地評價單增李斯特菌特定的污染來源[23]。

基因分型的方法包括了基于基因片段的亞型技術[脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）、擴增片段長度多態性（amplified-fragment length polymorphism，AFLP）、核糖體分型、質粒分型（plasmid typing）、多位點可變數目串聯重復分析（multilocus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA）和可變位點或缺檢測（detection of loci that are variably absent or present，VAP）]；基于PCR的分型技術[隨機擴增多態性DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP），PCR-限制性片段長度多態性（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）和重復元素PCR（repetitive element PCR，REP-PCR技術）]和DNA測序為基礎的亞型技術[多位點序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）、多毒力位點序列分型（multiple-virulence-locus sequence typing，MVLST）和單位點的測序和單核苷酸多態性（SNP）][24-25]。雖然PFGE法準確性最高，但由于操作步驟繁雜，且需要特殊儀器，在普通實驗室很難開展；而ERIC-PCR法操作簡便，無需特殊儀器，且重復性和區分能力同PFGE非常相近，更易于在普通實驗室中應用[26]。雖然根據Hunter等[27]介紹的計算方法，該分型方法的辨別指數值只有60%，但通過金莉莉等[28-30]從2002年使用ERICPCR來鑒定食品中的單增李斯特菌，以及本研究進一步表明ERIC-PCR能夠很好的區分不同來源單增李斯特菌菌株來看，ERIC-PCR為單增李斯特菌的流行病學調查以及有效防控單增李斯特菌的污染，提供了適用于普通實驗室的簡單、方便、快捷、準確的方法。

3 結論

ERIC-PCR技術能夠區分、鑒別不同來源的單增李斯特菌菌株，實現實驗室對食品中單增李斯特菌溯源及示蹤，為控制食品中單增李斯特菌的污染及防控李氏桿菌病提供了切實可行的工具。

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