乳腺癌干細胞的研究進展

復旦大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，上海市乳腺癌重點實驗室

復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

乳腺癌干細胞的研究進展

劉明明 楊恭

復旦大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，上海市乳腺癌重點實驗室

復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

楊恭，博士、教授、博士生導師。目前雙聘于復旦大學附屬腫瘤醫院和上海市第五人民醫院。主要從事婦科腫瘤和乳腺腫瘤發生、復發和轉移的相關研究。在正常卵巢上皮細胞永生化和轉化、RAS相關細胞因子及其受體、DNA損傷修復、腫瘤微環境和細胞衰老、基因組穩定性以及NF-κB相關基因轉錄調控等方面具有較為深入的研究，先后發表相關論文30多篇，其中以第一（包括并列第一）或通訊作者發表SCI研究論文14篇，主要雜志為JNCI、PNAS、CCR、Oncogene、Carcinogenesis、IJC、EJC、JBC、PLoS One、Tumor Biology等?，F主持國家自然科學基金、教育部課題和上海市科委課題5項。

乳腺癌干細胞是一類具有自我更新能力、多向分化潛能和高度致瘤能力的細胞亞群，與乳腺癌的發生、發展、復發、轉移以及治療抵抗等密切相關?，F就近年來乳腺癌干細胞的研究進展作一綜述。

乳腺癌； 干細胞； 信號通路；小干擾RNA

1 概 述

乳腺癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，發病率居女性癌癥第一位。全世界每年約有130萬新發病例，50萬死亡病例。近年來，我國乳腺癌發病率增長明顯，目前國內患者人數已超過50萬。約30%的早期乳腺癌患者經過嚴格治療之后，仍然會發生復發和轉移。對于首診時已經發生轉移的乳腺癌患者，傳統化療藥物起初效果較為明顯，但一段時間之后大多數患者會復發［1］。越來越多的研究表明，乳腺癌細胞中存在一部分具有自我更新、多向分化潛能以及高度致瘤能力的細胞亞群，稱為乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells)。由于乳腺癌干細胞與腫瘤的侵襲轉移、復發和治療抵抗密切相關，故已成為目前研究的熱點和難點?，F就近期乳腺癌干細胞的分離和鑒定、乳腺癌干細胞的來源、調節乳腺癌干細胞的信號通路、乳腺癌干細胞與小RNA、腫瘤微環境、治療抵抗等方面的研究進展作一綜述。

2 乳腺癌干細胞的分離和鑒定

2.1 生物標志物法

利用生物標志物(biomarker)進行腫瘤干細胞分離和鑒定，并在免疫缺陷鼠模型上驗證致瘤能力，是廣泛應用的腫瘤干細胞分離和鑒定方法。Al-Hajj等［2］在2003年首次發現并分離了乳腺癌干細胞，并運用細胞表面標志物ESA+/CD44+/CD24-在乳腺腫瘤細胞中篩選出一個細胞亞群，這一細胞亞群不表達CD2、CD3、CD10、CD16、CD18、CD31、CD64和CD140b等譜系標志(Lin-)，同時在體內具有極強的致瘤和侵襲轉移能力。將200個ESA+/CD44+/ CD24-或1 000個CD44+/CD24-細胞接種在聯合重癥免疫缺陷小鼠(NOD/SCID mice)上，即可形成腫瘤。相反，未經細胞表面標志篩選的乳腺腫瘤細胞，至少需要50 000個才能在NOD/SCID小鼠上形成腫瘤。目前，CD44、CD24、ESA已經成為廣泛認可的乳腺癌干細胞標志物。

乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)的主要作用是氧化細胞內的乙醛，起到解毒的作用。Ginestier等［3］的研究表明，ALDH也可以作為正常干細胞和腫瘤干細胞的標志物。利用ALDEFLUOR熒光檢測技術測定細胞中ALDH活性，或通過免疫組化檢測ALDH的表達水平，可以鑒別和篩選正常干細胞和腫瘤干細胞。與ESA+/CD44+/CD24-細胞類似，500個ALDH+的乳腺癌干細胞就能在NOD/SCID小鼠體內形成腫瘤，而即使接種50 000個ALDH-的乳腺癌細胞也不能形成腫瘤。ALDH和CD44/CD24這兩類標志物有部分重疊，在NOD/SCID小鼠上接種20個ALDH+/CD44+/CD24-/Lin-乳腺癌細胞就可以形成腫瘤［3］，這也說明聯合多個細胞標志物進行篩選所得到的細胞亞群可能更加接近腫瘤干細胞［4］。在HER-2陽性和三陰性乳腺癌細胞中，ALDH+細胞的比例更高，而ALDH的表達水平也與患者預后呈負相關［5-7］。

另一個篩選和鑒別乳腺癌干細胞的方法是使用熒光染料PKH26，這種熒光染料能選擇性標記靜止狀態的細胞，以區別分裂期的細胞［7］。因此，利用PKH26染料進行細胞篩選，再通過鼠移植瘤模型進行致瘤能力驗證，可以篩選出乳腺癌干細胞。Pece等［7］的研究結果表明，PKH26陽性細胞可以形成基底和Luminal兩種細胞，并且可以在去除脂肪墊的免疫缺陷鼠上重塑乳腺，PKH26陰性細胞則不能。

2.2 利用乳腺微球(mammosphere)模型篩選

乳腺微球篩選模型是應用最為廣泛的干細胞篩選及鑒別方法。在含有成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、谷氨酰胺的無血清培養液中，乳腺上皮細胞中未分化的干細胞或祖細胞可以懸浮生長并形成乳腺微球，而已經分化的細胞則不能正常生長。正常干細胞的這一特性也可以用于篩選和鑒別乳腺癌干細胞。研究表明，在乳腺癌細胞培養得到的乳腺微球中，表型為CD44+/CD24-/Lin-的乳腺癌干細胞比例增大［8］。

此外，分離、鑒別乳腺癌干細胞的方法還有側群分離技術［9］、免疫磁珠分選法［10］以及動物體內模型鑒定［11］等。

3 乳腺癌干細胞的來源

關于乳腺癌干細胞的來源，還存在爭議。目前有兩種不同但也互不矛盾的理論。一種理論認為，腫瘤干細胞來源于正常乳腺干細胞。調控正常干細胞自我更新和分化的信號通路發生異常，導致了乳腺癌干細胞的產生，也同時具備正常乳腺干細胞自我更新和分化潛能。支持這一觀點的依據主要是正常乳腺干細胞和乳腺癌干細胞之間的相似性，以及正常乳腺干細胞在漫長的生命周期中，容易發生突變而使得癌基因激活［12］。Al-Hajj等［2］認為，乳腺癌干細胞可能起源于乳腺基底部的干細胞或先驅細胞，因為乳腺基底部細胞表面信息和他們發現的乳腺癌干細胞具有高度的相似性。另一種觀點認為，乳腺癌干細胞是由已經分化的體細胞經上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)而產生。EMT是一種細胞表型改變的生理現象。在生理性EMT過程中，上皮細胞之間以及上皮細胞與基質之間的連接斷裂，上皮細胞遷移至身體的其他位置，到達預定地點后，又會經歷與EMT相反的過程(間質-上皮轉化，MET)［13］。生理性EMT在胚胎發育、機體愈傷等過程中都起到重要作用［13］。越來越多的證據表明，EMT與乳腺癌干細胞的形成、侵襲和轉移具有密切聯系。研究發現，TGF-β1等細胞因子和Twistor、Snail家族的多種轉錄因子可以誘導乳腺上皮細胞發生EMT。EMT過程顯著促進了腫瘤的侵襲和轉移［14-15］。Mani等［16］發現，人和鼠的正常乳腺上皮細胞經TGF-β1處理，或在細胞中誘導表達Twistor、Snail家族的轉錄因子可誘導EMT過程，上皮細胞轉變成間質細胞形態，并且表達波形蛋白和遷連蛋白等間質細胞標志物，同時細胞表型變為干細胞的CD44+/CD24-表型。這些細胞在體外形成乳腺微球的能力和在體內的致瘤能力都顯著增強。Morel等［17］發現，激活Ras/MAPK信號傳導通路可以誘導乳腺上皮細胞發生EMT，細胞轉變成間質形態，同時E-cadherin蛋白表達減少，波形蛋白表達增加，細胞表型由CD44-/ CD24+變為CD44+/CD24-，形成乳腺微球等干細胞活性增強。這些研究結果均提示乳腺癌干細胞可能是在EMT過程中，由已分化的正常乳腺上皮細胞產生，但其機制目前尚未完全闡明。

4 調控乳腺癌干細胞的信號通路

與正常乳腺干細胞類似，Wnt、Notch、Hedgehog和Bmi等幾條信號通路被認為是調控了乳腺癌干細胞的自我更新和分化。有觀點認為，正是這幾條信號通路發生突變，導致了乳腺癌干細胞的產生［7,18］。而這幾條信號通路中的相關基因或蛋白可能成為靶向乳腺癌干細胞的治療靶點［19］。

β-catenin是Wnt信號通路中的重要組成部分。Kalluri等［20］研究發現，β-catenin在細胞中表達的位置不同時，呈現出兩種不同的作用。在細胞膜表面，與E-cadherin相互作用，保持上皮細胞之間的相互黏附，是EMT的標志物之一。而細胞質中的β-catenin可以進入細胞核，與T細胞轉錄因子(TCF)形成復合物，激活了Wnt信號通路和下游基因的轉錄，下游基因包括c-Jun、c-Myc、fibronectin、cyclin D1和Notch信號通路中的配體Jagged-1。Lee等［21］報道，polycomb家族的Mel-18(一種轉錄抑制因子)可以通過抑制PI3K/AKT信號通路阻滯細胞周期、抑制Bmi-1(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog)的表達。而敲除乳腺癌細胞系(MCF-7、SKBR3)中的Mel-18可以增強乳腺癌干細胞的自我更新和致瘤能力。Won等［22］研究表明，Mel-18的缺失可以激活Wnt/β-catenin/TCP通路，增加下游靶基因Jagged-1的轉錄及表達，Jagged-1激活Notch信號通路，增強了乳腺癌干細胞樣活性。

Notch信號通路的結構保守，由Notch1～4的4種受體，和Delta1～4，Jagged-1、2的6種配體組成。Notch配體與鄰近細胞的Notch受體結合能促進受體胞內部分(Notch intracellular domain，NICD)的斷裂，NICD進入細胞核作用于下游靶基因，促進了靶基因的轉錄和表達。Harrison等［23］報道，Notch4在乳腺癌干細胞中的表達水平顯著高于已分化的乳腺癌細胞。通過藥物或基因敲除手段抑制Notch4信號通路可以完全抑制乳腺癌干細胞的致瘤能力。由于 在調控乳腺癌干細胞中所起的重要作用，Notch通路也成為乳腺癌干細胞靶向治療的作用靶點。Qiu等［24］報道，Notch1的單克隆抗體(mAb)可以增強三陰性乳腺癌細胞系Sum149和患者來源三陰性乳腺癌細胞在裸鼠移植瘤中對多西他賽的敏感性。同時，Notch1 mAb可以抑制乳腺微球的形成，減少CD44+/CD24-表型的細胞［24-25］，說明Notch1 mAb可能成為靶向乳腺癌干細胞的治療藥物。

抑制轉錄因子Bmi-1和EZH2屬于polycomb家族成員，與組蛋白修飾有關，可以調控干細胞的自我更新，以及調控與細胞增殖、生長和分化相關基因的表達［26-28］。Pietersen等［29］報道，敲除小鼠體內的Bmi-1可以降低乳腺干細胞的活性，從而導致乳腺發育受損。Bmi-1在表型為CD44+/CD24-/Lin-的乳腺癌干細胞中也呈高表達，可以與Hedgehog通路共同促進乳腺微球的形成和乳腺癌干細胞的自我更新［30］。EZH2在分離得到的乳腺癌和胰腺癌干細胞中的表達水平顯著高于已分化細胞，通過RNA干擾介導的EZH2敲除后，乳腺癌干細胞樣活性喪失，維持干細胞樣活性的相關基因表達下調［31］。該報道同時認為，EZH2可以作為報告基因用于快速篩選腫瘤干細胞［31］。

還有文獻報道轉錄因子FOXC2在調控EMT和保持乳腺癌干細胞樣活性中起到了重要作用［32］。shRNA介導的FOXC2基因敲除抑制了干細胞的間質表型、乳腺微球形成能力和致瘤能力，而在人乳腺上皮細胞中過表達FOXC2基因可以促進干細胞樣活性，增強細胞轉移能力。血小板源性生長因子β(PDGFR-β)是受FOXC2調控的下游基因，PDGFR的抑制劑舒尼替尼(sunitinib)可以抑制FOXC2誘導的乳腺癌干細胞樣活性和癌細胞的轉移。

最近，Dong等［33］研究發現，腫瘤細胞的糖代謝與EMT以及乳腺癌干細胞也密切相關?；讟尤橄侔?basal-like breast cancer，BLBC)被認為是侵襲性強、易復發和遠端轉移、對化療藥物不敏感的一種乳腺癌。這種乳腺癌細胞高度表現出EMT特征，且擁有較強的乳腺癌干細胞樣性質。研究發現，BLBC細胞中被認為與EMT相關的Snail蛋白與組蛋白甲基化轉移酶G9A相互作用，招募了DNA甲基化轉移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)。這些蛋白組成Snail-G9A-DNMT1復合體作用于E-cadherin的啟動子，沉默了E-cadherin的表達誘導了EMT。Snail-G9A-DNMT1同時還作用于果糖-1，6-二磷酸酶(fructose-1,6-biphosphatase，FPB1)的啟動子，沉默了FPB1的表達。相比較而言，在Luminal型乳腺癌細胞中FPB1的表達量較高。FPB1的缺失增強了腫瘤細胞的糖酵解過程，增加了葡萄糖的攝取、生物大分子的合成以及四聚體丙酮酸激酶(PKM2)的產生，從而保持在缺氧環境下ATP的供給。FPB1的缺失還通過抑制線粒體復合物Ⅰ(mitochondrial complex Ⅰ)減少了氧氣分子的攝取和活性氧的產生。這一系列代謝和供能的改變，增強了β-catenin與T細胞因子(T-cell factor)的相互作用，進一步促進了乳腺癌干細胞樣活性和致瘤能力。這些結果表明，FPB1的缺失與EMT、乳腺癌干細胞樣活性以及從Luminal型乳腺癌向BLBC型轉變具有密切的聯系，也提示沉默E-cadherin和FPB1表達的Snail-G9A-DNMT1復合體可能成為治療BLBC及靶向乳腺癌干細胞的作用靶點。

5 乳腺癌干細胞與小RNA(micro RNA，miRNA)

miRNA是一類內源性的具有調控能力的非編碼RNA，可以根據“互補配對”原則識別、降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。越來越多的研究顯示，miRNA參與了乳腺癌干細胞的調控。Shimono等［34］發現乳腺癌干細胞與分化的、無致瘤性的乳腺癌細胞之間有37簇miRNA表達差異有統計學意義。miR-200c-141、miR-200b-200a-429和miR-183-96-182在乳腺癌干細胞、人和鼠正常乳腺干/祖細胞以及胚胎癌細胞中低表達。其中miRNA-200c高度抑制了正常的乳腺干細胞的“干性”，促使其分化為乳腺導管，同時miRNA-200c也可以抑制乳腺癌干細胞在體內形成腫瘤。

Let-7是另一個抑制乳腺癌干細胞活性的miRNA，可以抑制乳腺癌干細胞的自我更新、對藥物的抵抗和不對稱細胞分裂［35］。

miR-7是最近發現的一個抑制乳腺癌干細胞的miRNA。在體外實驗中，可以調控KLF4的表達，抑制乳腺癌干細胞的自我更新和侵襲能力。KLF-4是誘導干細胞多能性的關鍵基因。在鼠模型中，miR-7也可以通過調控KLF4的表達抑制乳腺癌干細胞向腦部轉移［36］。此外，miR-7在乳腺癌細胞中的表達水平與波形蛋白呈負相關，與E-cadherin呈正相關，并被認為通過調控黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抑制乳腺癌細胞的EMT過程和侵襲轉移［37］。所以，miRNA-7可能通過靶向多個基因調控了乳腺癌干細胞。

此外，miR-21是一個促進干細胞活性的miRNA。研究發現，乳腺癌細胞系MCF-7經干細胞培養條件所形成的乳腺微球中，ALDH1+和CD44+/CD24-等干細胞表型的細胞顯著增加，同時細胞表達N-cadherin、波形蛋白等間質細胞標志物。在這些細胞中，缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF -1α)和miR-21均表達上調，而通過antagomir抑制miR-21可以逆轉EMT過程，下調HIF-1α表達，抑制細胞的侵襲性和轉移［38］。

6 乳腺癌干細胞和腫瘤微環境

大量研究表明，炎性反應和腫瘤之間存在密切的聯系。間質細胞、腫瘤相關成纖維細胞、上皮細胞、免疫細胞以及其分泌的促炎細胞因子、生長因子等細胞因子共同形成了腫瘤微環境，為腫瘤的發生、發展提供了條件，是腫瘤形成過程中必不可少的重要環節。在乳腺癌細胞中，白介素6(interleukin-6，IL-6)結合至其受體與GP130組成的復合物上，激活STAT3/ NF-κB信號通路，導致更多的IL-6轉錄和分泌，從而形成了正反饋循環，而IL-6、NF-κB的激活可以通過促進EMT和乳腺癌干細胞的自我更新，促進腫瘤的生長和轉移［39-41］。在shRNA介導Syndecan-1(CD138)敲除的乳腺癌中，IL-6及其受體IL-6R、細胞因子CCL-20均下調，IL-6/STAT3/NF-κB信號通路失活，導致乳腺癌干細胞活性降低，說明Syndecan-1通過IL-6/STAT3/NF-κB信號通路調控了乳腺癌干細胞［42］?；谠谡{控乳腺癌干細胞中的重要作用，IL-6/STAT3/NF-κB 信號通路也成為開發靶向腫瘤干細胞治療的作用靶點。Lin等［43］報道，丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)可以通過抑制這一信號通路，減少IL-6、STAT3、磷酸化STAT3、NF-κB和cyclin D1的表達，減少乳腺微球的形成，抑制乳腺癌干細胞在體內的致瘤性和裸鼠移植瘤的生長。

另有研究表明，IL-8的受體CXCR1在乳腺癌干細胞中高表達，而IL-8結合到CXCR1激活了下游的信號通路，促進了乳腺癌干細胞的自我更新。在鼠移植瘤模型中，用CXCR1的小分子拮抗劑repertaxin阻斷這一信號通路，可以顯著減少乳腺癌干細胞的數量，減少腫瘤的發生和轉移［44］。Singh等［45］用直接來源于患者的乳腺癌細胞進行乳腺微球形成實驗，發現IL-8的表達水平與乳腺微球的大小和形成率呈正相關，重組的IL-8可以增加乳腺微球的形成；EGFR拮抗劑拉帕替尼(lapatinib)和CXCR1/2的小分子拮抗劑可以抑制IL-8刺激乳腺微球形成的作用，特別是在HER-2陽性的乳腺癌細胞中，CXCR1/2的小分子拮抗劑與拉帕替尼產生協同作用。

此外，Sigurdsson等［46］報道，基質中成肌纖維細胞分泌的肝細胞生長因子(hepatocyte growth factors，HGF)通過激活Wnt信號通路，誘導了乳腺癌細胞中EMT表型。TGF-β和TNF-α也可以通過促進EMT誘導乳腺癌干細胞的產生，以及保持干細胞樣活性［47-48］。

7 乳腺癌干細胞與腫瘤治療抵抗

腫瘤干細胞對傳統化療藥物的抵抗被認為是癌癥復發的根源［49］。新輔助化療后的原發乳腺癌患者經活檢取出的腫瘤細胞，用流式細胞儀檢測發現其中CD44+/CD24-的乳腺癌干細胞與化療前相比比例增加，乳腺微球形成能力也相應提高。相比較而言，拉帕替尼治療的HER-2陽性乳腺癌患者經活檢取出的腫瘤細胞，CD44+/CD24-表型的細胞并沒有明顯增加［50］。提示傳統化療的同時，可以聯合使用靶向腫瘤干細胞的藥物以減少日后復發的可能，延長患者的生存期［50］。

一項臨床研究表明，經多西他賽聯合表柔比星的新輔助化療后，ALDH陽性腫瘤的比例顯著增加，ALDH陽性腫瘤獲得的完全病理緩解(pCR)率顯著低于ALDH陰性的腫瘤。但CD44+/ CD24-表型之間差異無統計學意義［51］。

Mao等［52］報道，在體外用紫杉醇處理乳腺癌細胞系MCF-7可以使得表型為CD44+/CD24-的乳腺癌干細胞比例增加，說明腫瘤干細胞對傳統化療藥物紫杉醇抵抗。在這些由紫杉醇處理而富集到的乳腺癌干細胞中，Notch1呈高表達。shRNA介導Notch1基因敲除后，這些乳腺癌干細胞對紫杉醇的敏感度增高，形成乳腺微球的能力也顯著降低。裸鼠體內實驗也表明，敲除Notch1基因后的腫瘤細胞對紫杉醇治療更加敏感。機制研究顯示，Notch1基因敲除后，ALDH1、NICD、Hes-1以及藥物轉運蛋白ABCG2表達下調。

抗血管生成治療被認為是腫瘤治療的重要組成部分，但治療乳腺癌的效果卻不能令人滿意。最近的一項研究表明，抗血管生成藥物舒尼替尼和貝伐單抗(bevacizumab)能增強乳腺癌細胞的侵襲和轉移［53］。在人乳腺癌細胞的裸鼠移植瘤中，因抗血管生成藥物能加劇腫瘤內部的缺氧環境，增加了乳腺癌干細胞的比例。HIF-1α在體外實驗中介導了缺氧條件誘導乳腺癌干細胞的過程。同時，在體外實驗和經舒尼替尼治療的人乳腺癌裸鼠移植瘤模型中顯示，Akt和β-catenin等干細胞調控信號通路在缺氧條件下被激活，導致了乳腺癌干細胞比例的增加。這些研究表明，正是由于缺氧環境誘導乳腺癌干細胞限制了抗血管生成藥物的治療效果，也說明這些抗血管生成藥物應當與靶向干細胞的治療藥物聯合使用。

8 結 語

乳腺癌干細胞的發現為研究乳腺癌的發病機制提供了新的方向，隨著乳腺癌干細胞致病機制、生物學特性和基因調控機制研究的不斷深入，對乳腺癌發生、發展以及關鍵調控點不斷闡明，靶向乳腺癌干細胞的治療方法也將進一步發展，期望能真正解決乳腺癌的轉移復發問題。

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The recent advances in breast cancer stem cells

LIU Ming-ming, YANG Gong (Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, the Key Laboratory of Breast Cancer of Shanghai, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

YANG Gong E-mail: yanggong@fudan.edu.cn

Breast cancer stem cells comprise a sub-population, which enables the capacity for self-renewal and the potentiality for differentiation and high tumorigenicity. Growing evidence suggests that breast cancer stem cells most likely contribute to tumor generation, progression, relapse, metastasis and therapeutic resistance. Herein, the recent advances in breast cancer stem cells were highlighted in this review.

Breast cancer; Stem cell; Signaling pathway; miRNA

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.08.011

R737.9

：A

：1007-3639(2013)08-0624-08

2013-07-15）

楊恭 E-mail: yanggong@fudan.edu.cn