一個基于NBD-NH2熒光團的增強型pH熒光探針及其細胞造影研究

李 靜 朱成成 何衛江

(南京大學化學化工學院配位化學國家重點實驗室，南京 210093)

許多細胞生理過程如細胞增殖和凋亡[1]、黏附[2]以及胞內離子輸運與動態平衡[3]等都涉及到質子化或去質子化過程，并因細胞微環境pH的改變而發生變化，因此精確檢測細胞內pH(pHi)對于理解細胞的生理和病理過程非常重要。相比于其他pH測定方法，熒光探針法進行pHi檢測由于靈敏度高、選擇性好、無損傷等優點已成為pHi檢測的主要手段。由于該方法可對pHi進行實時原位檢測，為理解胞內快速生理過程提供更為真實可靠的信息，因此pH熒光探針技術已是細胞生物學研究的重要工具之一，而發展高性能pHi熒光探針則將為該技術的應用奠定良好基礎。

文獻中已經報道的pH熒光探針大多是熒光素[4]、羅丹明[5]和氟硼二吡咯甲川類(BODIPY)熒光分子的衍生物[6]。這些探針主要通過識別基團的質子化/去質子化來改變信號團的熒光而實現pH響應。然而許多具有pH熒光響應能力的探針由于生物相容性低、細胞膜透過性差和激發/發射波長短等不足難以實現pHi的熒光造影[7-9]。由于細胞內pH大多在近中性，生理和病理條件下的pH變化也往往發生在近中性或弱酸性范圍內，因此發展響應范圍在近中性或弱酸性范圍內的pH探針十分重要。前述的熒光素、羅丹明和BODIPY是細胞研究中最常用的幾種熒光團，因此發展基于其他熒光團的pH探針也有利于進行細胞多重共染研究。由于4-氨基-7-硝基-1，2，3-苯并呋咱(NBD-NH2)熒光團是基于分子內電荷轉移機制(ICT)的熒光團，其較大的Stokes位移有利于克服造影中激發光的干擾。其激發和發射波長都在可見光區域，有利于克服細胞造影過程中的自發熒光干擾和光毒性等問題。該熒光團同時具有合適的量子產率、良好的生物相容性和光 穩定性[10-11]，已被用于氨基酸[12]、羧甲基纖維素[13]、Zn2+[14]、Hg2+[15]等熒光探針的構建。因此本研究擬利用NBDNH2熒光團來構建在弱酸或近中性條件下具有pH響應能力的熒光探針。

本研究中我們選用NBD-NH2作為熒光團、N-(4-吡啶甲基)乙二胺作為質子的響應基團設計合成了一個基于光致電子轉移(PET)機制的pH熒光探針NBD-Py，它的合成路線如式1所示。研究同時還合成了該探針不含吡啶的類似物NBD-en，用以對比它們的pH熒光響應行為。Taliani等曾合成該類似物作為中間體與苯基吲哚二酮偶聯作為外周型苯二氮卓類受體的熒光探針[16]。探針NBD-Py中的N-(4-吡啶甲基)乙二胺作為質子受體，其吡啶N和二烷基胺N均可通過PET效應猝滅NBD-NH2的熒光[17]。該受體質子化時可阻斷PET效應并導致探針熒光增強。設計中選擇4-吡啶甲基而非常見的2-吡啶甲基的連接方式，目的是盡量避免形成適于金屬配位的1，4-螯合結構以降低金屬對探針pH響應行為的干擾。其類似物NBD-en的質子受體為乙二胺，質子化乙二胺的pKa約為10.66，但NBD-en本身的pKa約在8.29，無法應用于中性或弱酸性pH的檢測。雖然質子化吡啶的pKa約為5.19，本研究發現吡啶與乙二胺在NBD-Py中的組合可以使整個受體質子化后的表觀pKa接近7.0，從而獲得對弱酸和近中性pH響應的能力。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

合成NBD-Cl的原料2，6-二氯苯胺為國內工業品，4-吡啶甲醛購買于Sigma公司。NBD-en根據文獻合成[16]。合成實驗中所用溶劑和其他試劑均來自南京大學化學化工學院采購的國產試劑，使用前未做進一步純化。所有光譜測試中使用的溶劑都是購自Aldrich公司的光譜純溶劑，所用水是MILIPORE處理的超純水。核磁共振譜在Bruker DRX-500核磁儀 (500 MHz)上采集，高分辨質譜由Bruker AutoflexⅡMALDI-TOF測定。熒光光譜由Fluoromax-4熒光光譜儀記錄，紫外-可見光譜用Perkin Elmer Lambda 35紫外可見分光光度計測定。pH值用Sartorius PB-10精密pH計測定。熒光造影用OLYMPUS IX81激光共聚焦熒光顯微鏡完成。

1.2 NBD-Py的合成和表征

NBD-Py的合成路線如式1所示，其中NBD-Cl和N-(4-吡啶甲基)乙二胺分別根據文獻方法在本實驗室合成[18-19]。將 10 mL NBD-Cl(400 mg，2 mmol)甲醇溶液攪拌下逐滴加入到N-(4-吡啶甲基)乙二胺(300 mg，2 mmol)的甲醇溶液中(10 mL)。在室溫條件下維持反應并用TLC(VCH2Cl2/VCH3OH=20)跟蹤至原料反應完全。減壓脫去溶劑后殘余物通過硅膠柱層析

(VCH2Cl2/VCH3OH=25)分離得到橘黃色固體NBD-Py(106 mg，yield 16.9%)。1H NMR(500 MHz，(CD3)2SO)δ：2.84(t，J=6.2，2H)，3.60(t，J=6.2，2H)，3.78(s，2H)，6.45 (d，J=8.9，1H)，7.34 (d，J=5.7，2H)，8.47 (d，J=5.7，2H),8.51(d，J=8.9，1H)。13C NMR(125 MHz，(CD3)2SO) δ：43.92,47.02,51.70,99.73,121.04,123.41,138.32,144.60,144.94,145.90,149.82and150.23。ESI-HRMS(positive mode，m/z)：calcd.315.1206；Found 315.1201 for[M+H]+。

式1 化合物NBD-en和探針NBD-Py的合成Scheme 1 Compound NBD-en and the synthesis of NBD-Py

1.3 NBD-Py和NBD-en的光譜測試

將NBD-Py的儲備液用HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3；pH 7.40)稀釋成 10 μmol·L-1溶液(VDMSO∶VHEPES=1∶99)，然后分別測量探針的熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。量子產率測定時選用 4-甲氨基-7-硝基-1，2，3-苯并呋咱(NBD-NHCH3)作為基準物[20]，以其最大激發波長458 nm為NBD-Py探針的激發波長，對基準物和探針分別進行紫外吸收測定與熒光光譜測定。量子產率通過如下公式進行計算[21]：

Φf表示量子產率，公式中下標R與S分別代表基準物與樣品，A表示相應激發波長處的吸光度，n為樣品溶液的折射系數，F表示化合物溶液熒光發射光譜的積分面積。

NBD-Py的pH滴定和響應可逆性實驗在含1%DMSO的水溶液中進行。儲備液用H2O稀釋成10 μmol·L-1。溶液pH的調節是通過加入少量(幾微升)的HCl或NaOH水溶液，在迅速測定pH后快速完成紫外-可見吸收光譜或熒光光譜測試。NBD-Py對金屬離子的熒光響應性能在DMSO/HEPES(1∶99，V/V，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH 7.40)中測試，測試濃度是 10 μmol·L-1，其中堿金屬和堿土金屬的離子濃度是探針濃度的1 000倍，而其他金屬離子和探針濃度相等。

1.4 NBD-Py探針的細胞造影研究

利用熒光共聚焦顯微鏡考察了NBD-Py對HeLa細胞內pH的造影能力。細胞內pH的調節是通過在孵育介質中加入尼日利亞菌素 (10 ng·mL-1)使細胞內外pH一致，再通過調節孵育介質的pH實現的[22]。具體操作為室溫下將HeLa細胞與探針NBD-Py(10 μmol·L-1)共同孵育 30 min，孵化的介質為含有尼日利亞菌素且具有不同pH(4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0)的PBS緩沖溶液。造影直接用Olympus IX81激光共聚焦熒光顯微鏡完成。通過和溶酶體熒光染色試劑 (Lysotracker Red DND-99)對HeLa細胞共染確定了NBD-Py探針的溶酶體靶向性能。

2 結果與討論

2.1 NBD-Py和NBD-en的紫外和熒光光譜

首先我們研究了NBD-Py探針在DMSO/HEPES(1∶99，V/V，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3,pH 7.40)體系中的光譜行為。如圖1所示，NBD-Py探針最大紫外吸收波長為475 nm(消光系數6.5×104L·mol-1·cm-1)，在 344 nm 處還有一弱吸收峰(消光系數 2.1×104L·mol-1·cm-1)。它們可以分別指認為探針分子4-氨基與7-硝基間的ICT效應所引起的吸收峰(ICT帶)和NBD熒光團本身的π-π*躍遷吸收帶。其類似物NBD-en的ICT和π-π*吸收峰的位置與NBD-Py基本相似，消光系數也相似(467 nm，4.5×104L·mol-1·cm-1；336 nm，1.5×104L·mol-1·cm-1)。探針NBD-Py的最大激發波長與最大發射波長分別為465和539 nm，均處于可見光區，其較大的Stokes位移(74 nm)，有助于降低造影過程中激發光的干擾。其類似物NBD-en的最大激發和發射波長分別為464和533 nm。從圖1可以看出NBD-Py的量子產率要小于NBD-en，而實際以NBD-NHCH3作為基準物進行的量子產率測定也表明NBD-Py的量子產率為0.011，而NBD-en則為0.028。

圖1 NBD-en(10 μmol·L-1,實線)和 NBD-Py(10 μmol·L-1,虛線)在含1%DMSO HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.40) 中 的 紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜Fig.1 UV-Vis absorption and emission spectra of NBD-en(10 μmol·L-1;solid line)and NBD-Py(10 μmol·L-1;dashed line)in HEPES buffer(50 mmol·L-1,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.40)containing 1%DMSO

2.2 NBD-Py的紫外可見和熒光pH滴定

圖2 NBD-Py(10 μmol·L-1,VDMSO/VH2O=1/99)水溶液在不同pH條件下的吸收光譜Fig.2 UV-vis absorption spectra of NBD-Py(10 μmol·L-1)obtained in aqueous solution(VDMSO/VH2O=1/99)at different pH values

NBD-Py探針的pH紫外-可見光譜滴定實驗是在含1%DMSO的水溶液中進行的。如圖2所示，NBD-Py探針的吸收光譜在pH 3.4～10.97范圍內變化不明顯，474 nm處吸收有微弱的下降，而344 nm處的吸收有微弱上升，同時未觀察到吸收峰的移動。作為ICT熒光團，其穩定的吸收光譜表明其作為電子給體的4-氨基在此pH范圍內沒有發生質子化或去質子化效應，然而這不能排除側鏈氨基或吡啶發生質子化或去質子化作用。

NBD-Py的pH熒光滴定在同樣的溶液中完成。如圖3(a)所示，NBD-Py在pH 3.0～5.0之間具有較強的熒光，并且相對穩定。當pH進一步升高時NBDPy的熒光強度逐漸降低，直至當pH＞8.0時，NBDPy的熒光強度再次趨于穩定。在pH逐漸升高的過程中其熒光發射波長未見移動，這也表明pH變化過程中NBD-NH2熒光團的ICT效應沒有變化，也表明給電子基4-氨基未發生質子化，這也與紫外pH滴定的結果相一致。顯然，NBD-Py在pH 5.0～8.5范圍內顯示的pH依賴的熒光強度變化與探針質子受體中側鏈氨基或吡啶的質子化有關。當pH＞8.0時，側鏈氨基和吡啶均未質子化，相應N原子上的孤對電子可以發生光致電子轉移(PET)而猝滅熒光團的熒光，NBD-Py顯示較弱的熒光。當pH逐漸降低時，側鏈氨基和吡啶逐漸發生質子化，相應的PET效應被抑制并導致熒光團熒光逐漸恢復，熒光強度逐漸增強。當pH＜5.0時，側鏈氨基和吡啶已被完全質子化，PET效應完全被阻斷，熒光達到最強。NBD-Py熒光的pH依賴行為表明該探針是一個基于PET機制的pH熒光探針，其質子化導致的熒光增強倍數達到～9.0(FpH5.0/FpH8.5)。利用NBD-Py探針最大發射波長539 nm處的熒光強度對pH作圖，得到圖3(b)顯示的熒光pH滴定曲線。利用Henderson-Hasselbach方程對該滴定曲線進行擬合的結果表明NBD-Py探針的pKa為～6.48[23]。這一數值表明該探針適合于中性到弱酸性pH的檢測，達到了研究的設計目的。

圖3 (a)NBD-Py水溶液(10 μmol·L-1,VDMSO/VH2O=1/99,λex=465 nm)在不同pH條件下的熒光發射光譜;(b)基于539 nm處熒光強度的pH滴定曲線(■)及pKa擬合曲線Fig.3 (a)Emission spectra of NBD-Py(10 μmol·L-1)in aqueous solution(VDMSO/VH2O=1/99)obtained at different pH values(pH 3.79～10.97);(b)Fluorescent pH titration profile based on the normalized emission intensity at 539 nm(■)and the related pKasimulation profile;λex=465 nm

圖4 NBD-en 水溶液(10 μmol·L-1,VDMSO/VH2O=1/99,λex=465 nm)在不同pH的熒光發射光譜。插圖為基于533 nm處熒光強度的pH滴定曲線(■)及pKa擬合曲線Fig.4 Emission spectra of NBD-en(10 μmol·L-1)in aqueous solution(VDMSO/VH2O=1∶99)obtained at different pH values(pH 3.10～12.04);Inset is the fluorescent pH titration profile based on the normalized emission intensity at 533 nm and the related pKasimulation profile;λex=465 nm

NBD-en的pH熒光滴定表明其熒光在pH＜7.0時最強，而且其強度在此范圍內不受pH影響。在pH 7.0～10.5范圍時，該化合物的熒光強度隨著pH值的升高而逐漸降低，而發射波長沒有明顯的移動。在pH高于10.0以上時熒光趨于穩定。在pH 7.0～10.5范圍內pH依賴的熒光變化同樣可以歸結為側鏈氨基在較低pH時(pH＜10.0)發生質子化有效阻斷側鏈氨基的PET效應所致。NBD-en探針側鏈氨基質子化導致的熒光強度增強倍數約為16(FpH6.91/FpH9.88)。擬合發現NBD-en的pKa約為8.29。比較NBD-Py與NBD-en的pKa可以發現吡啶的引入有效地將熒光分子中質子受體的pKa從8.29降低到6.48。一般認為仲胺的堿性要強于伯胺，所以NBDPy結合質子能力低于NBD-en的原因是吡啶結構本身的影響而非伯胺轉變為仲胺所致。實際上在NBD-Py探針中存在著側鏈氨基和吡啶的兩個質子化過程，這兩個質子化過程相互影響，導致了居中的表觀pKa。顯然，這一調節質子受體pKa的策略應可作為調節pH熒光探針pH響應范圍的有效手段。

2.3 NBD-Py探針pH響應行為的抗金屬干擾能力和可逆性

細胞中存在大量高濃度的化學物種，它們均可能與探針發生相互作用而影響探針的pH響應行為，尤其胞內的陽離子往往會與質子相競爭。其中高濃度的 Na+、K+、Ca2+、Mg2+和一些其他常見的過渡金屬離子的影響往往比較明顯。實用的胞內pH造影探針其pH響應行為應不受胞內其他金屬離子的干擾。本研究對NBD-Py的抗金屬干擾能力也進行了測試。測試的介質為pH 7.40的HEPES緩沖溶液，測試中引入高濃度的堿金屬或堿土金屬離子是為模擬細胞內環境。由圖5(a)可以看出，當與探針等量的過渡金屬離子如 Fe3+、Zn2+、Cu2+、Hg2+、Cd2+等加入到NBD-Py探針溶液中時，其熒光強度及發射波長均未發生明顯的變化。另外加入探針1 000倍量的 Na+、K+、Ca2+或 Mg2+同樣未影響探針的熒光。這一結果表明NBD-Py探針能專一地響應pH而不受胞內常見金屬離子的干擾。這一優點應與設計中選擇4-吡啶甲基修飾乙二胺盡量減少質子受體對金屬的螯合作用有關。這些結果表明NBD-Py具有胞內pH造影的前景。

圖5 (a)NBD-Py(10 μmol·L-1)在 HEPES 緩沖體系(VDMSO/VHEPES=1/99,50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.40)中對各種金屬離子的熒光響應(根據 535 nm處熒光強度繪制，過渡金屬離子濃度為10 μmol·L-1，K+、Na+、Ca2+、Mg2+濃度為 10 mmol·L-1);(b)NBD-Py 在 pH 4.50～9.45 間振蕩時在 535 nm 處的熒光變化;λex=465 nmFig.5 (a)Fluorescence responses of NBD-Py(10 μmol·L-1)in aqueous solution(VDMSO/Vwater,1/99;50 mmol·L-1 HEPES,100 mmol·L-1KNO3;pH=7.40)to different metal cations based on the emission at 535 nm.The final concentration of Na+,K+,Ca2+and Mg2+is 10 mmol·L-1,respectively,while those for other cations are 10 μmol·L-1;(b)Fluorescence intensity of NBD-Py at 535 nm upon adjusting pH between 4.50 and 9.45 pH in a reversible manner;λex=465 nm

由于細胞內pH值往往發生振蕩變化，并且非均勻分布，因此pH探針具有可逆響應能力十分重要。因此我們還對NBD-Py對pH響應的可逆性進行了測試。實驗中我們循環調節測試溶液的pH使其pH在4.50和9.45之間振蕩，并反復測試其熒光光譜。如圖5(b)所示，NBD-Py的熒光至少在4個循環內在相同的pH下保持穩定，表明該探針具有較好的可逆響應pH的能力，可以實現對細胞內pH振蕩變化的有效響應。

2.4 NBD-Py細胞造影研究

圖6 NBD-Py對HeLa細胞內pH的激光共聚焦熒光造影圖。HeLa細胞分別用含NBD-Py(10 μmol·L-1)的具有不同pH的PBS緩沖溶液孵育30min(25℃)進行造影測試。介質中同時含有尼日利亞菌素(10 ng·mL-1);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)分別是在pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0條件下孵育的細胞造影圖，造影熒光通道為500～600 nm，激發波長為488 nm;(h)為經歸一化后細胞內平均熒光強度對pH的變化曲線Fig.6 Confocal pHiimaging of HeLa cells stained by NBD-Py(10 μmol·L-1)at different pH values;The cells were incubated for 30 min with NBD-Py in PBS buffers of different pH at 25C,which containing nigericin(10 ng·mL-1);(a)pH 4.0;(b)pH 4.5;(c)pH 5.0;(d)pH 5.5;(e)pH 6.0;(f)pH 6.5;(g)pH 7.0;Band path:500～600 nm;excitation,488 nm;(h)Normalized average intracellular fluorescent intensity versus pHi

圖7 在 pH 為 4.0室溫條件下，用 10 μmol·L-1NBD-Py和 1 μmol·L-1LysoSensor Red DND-99孵化 30 min后的HeLa細胞共聚焦造影圖;(a)HeLa細胞明場圖;(b)488 nm激發時下由500到600 nm造影通道獲得的造影圖;(c)565 nm激發時下由570到600 nm造影通道獲得的造影圖;(d)為(b)和(c)的疊合圖Fig.7 Confocal imaging of HeLa cells constained by 10 μmol·L-1NBD-Py and 1 μmol·L-1LysoSensor Red DND-99 after incubation for 30 min at 25℃(pH 4.0):(a)Bright field image;(b)image obtained with a band path from 500 to 600 nm upon excitation at 488 nm(NBD-Py);(c)image obtained with a band path from 570 to 600 nm upon excitation at 565 nm(LysoSensor Red DND-99);(d)overlay of(b)and(c)

利用共聚焦熒光顯微鏡我們進一步考察了NBD-Py細胞內pH造影能力。造影使用的HeLa細胞與探針 NBD-Py(10 μmol·L-1)共同孵育 30 min,孵育的介質為加入了尼日利亞菌素(10 ng·mL-1)的具有不同pH的PBS緩沖溶液。孵育結束后進行單通道模式共聚焦造影。如圖6所示，當孵育溶液pH為4.0時，HeLa細胞內顯示的平均熒光強度較強。當pH逐漸升高時，胞內熒光逐漸減弱，直至pH7.0時熒光強度趨于穩定。胞內pH的熒光響應圖(圖6h)表明該探針在HeLa細胞內可在pH 4.0～6.5內線性響應pHi。這一響應趨勢和行為類似于溶液中觀察到的現象，但顯然其響應的線性范圍與溶液中略有不同，胞內環境與溶液模擬環境之間的區別可能是導致這一差異的原因。胞內pH造影表明NBD-Py具有良好的細胞膜透過能力，并且具有pHi響應能力，是一個可對弱酸性胞內環境進行pH造影的良好探針。同時該探針具有良好的細胞相容性，在測試過程中未見明顯的細胞凋亡現象。同時從圖6(a～g)可以看出，探針主要分布于胞漿中，顯示了清晰的點狀熒光分布，表明探針可能具有特定細胞器的選擇性結合能力。為了進一步確定NBD-Py探針的亞細胞分布，我們利用溶酶體熒光染色試劑Lysotracker Red DND-99和NBD-Py探針對HeLa細胞進行了共定位研究。由圖7d可知，NBD-Py和Lysotracker Red DND-99的熒光在細胞中有很好的重疊，兩者的共定位系數達90%以上。因此可以認為NBD-Py具有較好的溶酶體靶向能力，可以有效地檢測溶酶體的pH變化。

3 結 論

本文將4-吡啶甲基修飾乙二胺形成的質子受體與NBD-NH2熒光團偶聯構建了一個具有在弱酸性和近中性pH范圍內敏感響應細胞內pH的熒光探針NBD-Py。該探針在pH 5.0～8.5范圍內顯示隨pH降低導致的熒光增強響應，并且顯示了良好的可逆響應能力和抗金屬干擾性能，pKa約為6.48。研究表明探針質子受體中吡啶的引入是導致其弱酸和近中性pH響應的關鍵。細胞造影研究不僅證實了其pHi造影能力，而且發現了其良好的溶酶體靶向性能，為研究細胞溶酶體pH相關生理和病理過程提供了可靠工具。

[1](a)Gottlieb R A,Giesing H A,Zhu J Y,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,1995,92:5965-5968(b)Gottlieb R A,Dosanjh A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1996,93:3587-3588

[2]Yuli I,Oplatka A.Science.,1987,235:340-342

[3](a)Liang E,Liu P,Dinh S.Int.J.Pharm.,2007,338:104-109(b)Montrose M H,Friedrich T,Murer H.J.Membr.Biol.,1987,97:63-78

[4](a)Donoso P,Beltran M,Hidalgo C.Biochemistry,1996,35:13419-13425(b)Hille C,Walz B.J.Exp.Biol.,2008,211:568-576

[5](a)Tang B,Yu F,Li P,et al.J.Am.Chem.Soc.,2009,131:3016-3023(b)Zhu H,Fan J L,Xu Q L,et al.Chem.Commun.,2012,48:11766-11768

[6](a)Hecht M,Kraus W,Rurack K.Analyst.,2013,138:325-332(b)WANG Yan-Wei(王艷瑋),LI Min(李敏),SHEN Zhen(沈珍),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2008,24:1247-1252

[7]Hutt J T,Jo J,Olasz A,et al.Org.Lett.,2012,14:3162-3165

[8]Hecht M,Krausb W,Rurack K.Analyst.,2013,138:325-332

[9](a)LIU Chao(劉超),SUN Hui(孫輝),YANG Xiao-Liang(楊曉亮),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2011,27:2121-2127(b)Percivalle C,Mahmood T,Ladame S.Med.Chem.Commun.,2013,4:211-215

[10]de Silva A P,Gunaratne H Q N,Gunnlaugsson T,et al.Chem.Rev.,1997,97:1515-1566

[11]Ishiguro K,Ando T,Goto H.Biotechniques,2008,45:465-468

[12](a)Andrews W W,Hill F C,Allison W S.J.Biol.Chem.,1984,259:14378-14382(b)Santa T,Matsumura D,Huang C Z,et al.Biomed.Chromatogr.,2002,16:523-528

[13]Wang Q,Lawrence D S.J.Am.Chem.Soc.,2005,127:7684-7685

[14]Qian F,Zhang C L,Zhang Y M,et al.J.Am.Chem.Soc.,2009,131:1460-1468

[15](a)Kim S H,Youn N J,Park J Y,et al.Bull.Korean Chem.Soc.,2006,27:1553-1556(b)WANG Pi(王丕),CHEN Ma-Liang(陳馬亮),GUO Wei(郭煒).J.Shanxi Univ.:Nat.Sci.Ed(Shangxi Daxue Xuebao:Ziran Kexue Ban),2011,34:73-76

[16]Taliani S,Simorini F,Sergianni V,et al.J.Med.Chem.,2007,50:404-407

[17]Bissell R A,de Silva A P,de Silva S A,et al.J.Chem.Soc.Perkin Trans.,1992,2:1559-1564

[18]HE Juan(何娟),CHANG Jun-Biao(?？?,CHEN Rong-Feng(陳榮峰),et al.Chin.J.Pharmaceut.(Zhongguo Yiyao Huagong Zazhi),2012,33:425-426

[19]Wang K,Cui J,Xie L,et al.Heteroatom Chemistry,2009,20:418-424

[20]Parker C A,Rees W T.Analyst,1960,85:587-600

[21]Lakowicz J R.Principle of Fluorescence Spectroscopy.New York:Klumer Academic,1999:52-53

[22]Thomas J A,Buchsbaum R N,Zimniak A,et al.Biochemistry,1979,18:2210-2218

[23](a)Henderson L J.Am.J.Physiol.,1908,21:173-179(b)Hasselbalch K A.Biochem.Z,1917,78:112-144