微生物發酵生產5-氨基乙酰丙酸研究進展

康振，張俊麗，楊森，堵國成，陳堅

1 江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122

2 江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122

3 江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122

4 江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫 214122

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是一種非蛋白類的5碳氨基酸，廣泛存在于細菌、真菌、植物以及動物中。在生物體內，5-ALA 是合成吡咯類化合物(如血紅素、細胞色素、葉綠素以及維生素B12)的關鍵中間代謝產物。近年來，5-ALA 作為一種安全、選擇、滲透性好的光動力學藥物在醫學領域引起廣泛關注。目前，5-ALA 已經應用于諸多癌癥(如皮膚癌、膀胱癌、消化道癌及肺癌等)的診斷與光動力治療(PDT)中[1]。此外，由于5-ALA 在環境中易降解，無殘留，對哺乳動物無毒性，因此，5-ALA在農業上具有重要的應用前景(如作為一種無公害的綠色農藥、除草劑以及植物生長調節劑)[1-2]。

目前，5-ALA 主要通過化學法合成[3]，然而由于化學合成反應步驟多、副產物多、分離提純難、5-ALA 的得率低以及環境污染嚴重等問題，生物法合成5-ALA 成為未來研究發展的趨勢[1]。自然界中，5-ALA 的合成存在兩條途徑[1]，一條是C4途徑(因4碳的琥珀酸而得名[4])，另一條是C5途徑(因5碳的谷氨酸而得名[5])。前者較為簡單，由5-氨基乙酰丙酸合酶(5-aminolevulic acid synthase,ALAS)催化琥珀酰CoA 和甘氨酸生成5-ALA，該途徑主要存在于光合細菌(如紫細菌屬等)、真菌以及動物體中；后者由谷氨酸起始經過三步酶促反應生成5-ALA[1]，該途徑廣泛存在于植物、藻類以及細菌中(如腸桿菌屬等)。隨著基因重組技術、代謝工程以及合成生物學的發展，構建性狀優良的微生物工程菌株從而實現5-ALA 的微生物法合成已經成為現實。

1 自然界5-氨基乙酰丙酸生產微生物的篩選、誘變以及培養優化

早期，微生物合成5-ALA 的相關研究主要集中于從自然界中篩選5-ALA 的生產菌株。1970年，Beale 等[6]篩選到一株小球藻Chlorella vulgaris，研究發現C.vulgaris 可以利用CO2積累5-ALA，隨后其他不同小球藻也被報道具有合成積累5-ALA 的能力[7-8]。然而，由于微藻類積累5-ALA 的濃度及應用價值較低，后來篩選工作主要集中于從自然界中篩選生產5-ALA 的光合細菌。1987年，Sasaki 等[9]篩選到一株類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides，通過人為添加5-ALA 的兩個前體物琥珀酸和甘氨酸，5-ALA 積累到2.0 mmol/L，隨后進一步添加乙酸和丙酸，5-ALA 產量提高至4.2 mmol/L[10](表1)。在獲得優良的母本菌株后，為進一步提高R.sphaeroides 菌株的生產性能，研究者采用亞硝基胍(1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidin)等誘變劑對菌株R.sphaeroides 進行多輪誘變，5-ALA 的產量得到顯著提高[1](表1)。

在生物體內，5-ALA 可以通過5-ALA 脫水酶(HemB，由hemB 基因編碼)的催化轉化為膽色素原(Porphobilinogen)。研究發現乙酰丙酸(Levulinic acid)是5-ALA 脫水酶的競爭性抑制劑，因此，人為添加適量的乙酰丙酸抑制5-ALA脫水酶的活性以積累5-ALA 成為發酵優化中的一個策略[11]。另一方面，通過優化培養條件，突變菌株R.sphaeroides CR720積累5-ALA 達到27.5 mmol/L[12]。但由于光合細菌發酵周期長、且發酵過程需要光照，使得發酵成本高，因而不適合大規模工業化發酵生產。

2 微生物全細胞催化合成5-氨基乙酰丙酸

隨著生物技術的發展，采用模式微生物表達異源蛋白基因，實現酶的活性表達或者構建新的代謝途徑已經獲得飛速發展。大腸桿菌Escherichia coli 這一模式微生物由于其諸多優點(如遺傳背景清晰、遺傳操作工具完善、操作簡單、營養要求簡單等)而受到研究者的青睞。1993年，Neidle 等[13-14]從R.sphaeroides 菌株中成功克隆編碼ALAS 的兩個同工酶基因hemA和hemT。研究發現，在R.sphaeroides 菌株中，hemA 基因發揮主要功能。隨后，van der Werf等[15]成功將來源于 R.sphaeroides 菌株中的hemA 基因克隆至E.coli，實現了hemA 基因的活性表達以及5-ALA 的異源生物轉化。通過ALAS 的酶學性質研究以及添加5-ALA 前體物甘氨酸、琥珀酸以及ATP，5-ALA 產量提高到22.0 mmol/L (表1)。

在基于C4途徑的全細胞催化中(圖1)，ALAS 發揮著最重要的作用，提高ALAS 的活力是實現5-ALA 高產的關鍵。2003年，Xie 等[16]考察了初始琥珀酸和葡萄糖濃度以及IPTG 誘導濃度對來源于R.sphaeroides 菌株的hemA 基因編碼的ALAS 的酶活力的影響，并且通過優化培養實現ALAS 的最大活力，5-ALA 產量提高至39.0 mmol/L (表1)?；谔岣逜LAS 的表達及活力，Fu 等將來源于R.sphaeroides 的hemA基因克隆至依賴于T7聚合酶的表達系統，并分析了E.coli BL21(DE3)和 Rosetta (DE3)(可優化表達稀有密碼子的菌株)的表達差異。研究發現，hemA 基因在Rosetta (DE3)菌株中實現了更好的表達，5-ALA 產量提高至29.0 mmol/L[17](表1)。同時，不同課題組分別從大豆根瘤菌Bradyrhzobium japonicum[18-19]、放射形土壤桿菌Agrobacterium radiobacter[20-22]、沼澤紅假單胞菌 Rhodopseudomonas palustris[23]菌株中克隆hemA 基因并在E.coli 中進行表達分析(表1)。研究表明，不同來源的ALAS 在E.coli 中的活性差異較大。Shin 等[24]發現通過共表達依賴于NADPH 的蘋果酸酶基因maeB，ALAS 的活性得到顯著提高，最終引起5-ALA 的高效積累，這表明5-ALA 的合成可能與細胞內的氧化還原電勢具有密切的關系。

在生物體內，5-ALA 的合成是吡咯類化合物合成的限速步驟，它的合成受到嚴格的調控(ALAS 受血紅素的反饋抑制)?；诖?，最近Zhang 等[25]從R.palustris 中克隆了ALAS 的兩個同工酶基因hemA 和hemO，研究發現由hemO基因編碼的ALAS 具有較高的抗反饋抑制能力(hemin)，最終通過表達基因hemO，5-ALA 產量達到48.1 mmol/L (表1)。

圖1 大腸桿菌中重組5-氨基乙酰丙酸C4合成途徑Fig.1 Recombinant C4 pathway engineered for 5-aminolevulinic acid biosynthesis in E.coli.PGD:3-phosphoglycerate dehydrogenase;ODH:2-oxoglutarate dehydrogenase;SCS:succinyl-CoA synthetase;SDH:succinate dehydrogenase;PHTA:phosphoserine aminotransferase;SHMT:serine hydroxymethyltransferase;ALAS:5-aminolevulinic acid synthase.The bold line means the genes need to be overexpressed for increasing ALA production.? indicates the reaction needs to be blocked.During biotransformation,glucose,succinate and glycine as substrates were added.

此外，研究發現甘氨酸對細胞有一定的毒性，當甘氨酸濃度大于23.0 mmol/L 時，菌體生長受到顯著抑制[15]。另外，最近研究表明，葡萄糖以及木糖對5-ALA 脫水酶的活性均有一定的抑制作用[22]。因此，為進一步提高5-ALA 的產量，發酵過程優化控制顯得尤為重要。Fu 等[26]通過控制流加發酵液的pH，5-ALA 產量提高至50.4 mmol/L (表1)。隨后，Lin 等[27]通過優化發酵碳源以及控制發酵pH，5-ALA 產量提高至56.0 mmol/L (表1)。

3 代謝工程改造微生物合成5-氨基乙酰丙酸

目前，基于C4途徑的全細胞生物轉化合成5-ALA 得到了長足發展。但研究報道中所用培養基多為營養豐富、實驗室用的LB 培養基，不利于5-ALA 的工業化生產。同時，甘氨酸對菌體的生長抑制作用使得發酵工藝相對復雜。因此，構建直接發酵葡萄糖生產5-ALA 的微生物菌株具有更大優勢。近年來，代謝工程作為一個強大的工具已經成功應用于微生物代謝的調控及工程菌株的構建中[28]。

最近，Kang 等[29]將來源于R.sphaeroides編碼ALAS 的基因hemA 分別克隆至野生型的E.coli MG1655菌株以及好氧琥珀酸發酵菌株E.coli QZ1111[30]中，并進行比較分析。研究發現，野生型的E.coli 在表達ALAS 后，以葡萄糖(111.1 mmol/L)為唯一碳源積累5-ALA 至0.6 mmol/L。而相同條件下好氧琥珀酸發酵菌株中5-ALA 產量為3.3 mmol/L (表1)。以上研究結果表明，通過對5-ALA 的C4相關途徑改造(圖1)，可以實現一步法發酵葡萄糖生產5-ALA。此外，通過對表達hemA 的好氧琥珀酸發酵菌株的代謝產物分析發現，琥珀酸由于過量而分泌到胞外。以上結果表明，為提高5-ALA 的高效合成，通過進一步代謝途徑改造實現甘氨酸的積累是非常必要的，如解除絲氨酸對3-磷酸甘油酸脫氫酶的反饋抑制(圖1)。

此外，Kang 等[31]首次通過改造 E.coli 5-ALA 的C5途徑(圖2)，實現了在無機鹽培養基中一步發酵葡萄糖生產5-ALA 的設想。

圖2 大腸桿菌中重組5-氨基乙酰丙酸C5合成途徑[31]Fig.2 Recombinant C5 pathway engineered for 5-aminolevulinic acid biosynthesis in E.coli[31].PDH:pyruvate dehydrogenase;GS:glutamate dehydrogenase;GluS:glutamyl-tRNA synthetase;GluTR:glutamyl-tRNA reductase;GSA-AM:glutamate-1-semialdehyde aminotransferase.

通過研究發現，由hemA 基因編碼的谷氨酰-tRNA 還原酶以及由hemL 基因編碼的谷氨酸-1半醛氨基轉移酶是C5途徑的限速酶，二者存在協同作用。通過單獨表達hemA 突變體基因以及共表達hemA 突變體基因和hemL 基因，5-ALA產量分別提高了5.7倍(1.3 mmol/L)和66倍(15.5 mmol/L)(對照菌株為轉化空載體的野生型E.coli)。同時發現，由gltX 基因編碼的谷氨酰-tRNA 合成酶對C5途徑中的編碼5-ALA 脫水酶的hemB 基因存在上調作用。

在E.coli 中，許多潛在的氨基酸轉運蛋白已經被鑒定出來[32]，并成功應用于氨基酸的發酵生產[33]。因此，為加速5-ALA 的胞外分泌，研究者對5-ALA 相關潛在的運輸蛋白載體YeaS[34](亮氨酸胞外轉運蛋白，由yeaS 基因編碼)以及RhtA[35](蘇氨酸和高絲氨酸胞外轉運蛋白，由rhtA 基因編碼)進行了分析，研究發現RhtA 轉運蛋白對5-ALA 具有較強的運輸能力，通過共表達rhtA 基因，胞外5-ALA 的產量提高了約46%(22.6 mmol/L)(對照菌株是共表達hemA 突變體和hemL 的E.coli)。最終，在優化發酵培養基(嚴格控制Fe2+濃度)的基礎上通過分批發酵，5-ALA 濃度最終為31.5 mmol/L(表1)(5-ALA/葡萄糖轉化率為16.8%)[31]。

表1 微生物發酵生產5-氨基乙酰丙酸Table 1 Microbial production of 5-aminolevulinic acid

4 展望

在過去幾年里，5-ALA 的微生物合成取得了巨大進步，實現微生物高效合成5-ALA 已經成為現實?；趯崿F5-ALA 的微生物法工業化生產，相關研究將主要集中于以下幾個方面：1)全細胞生物轉化法合成5-ALA：在該過程中，ALAS 的高活力以及抗血紅素的反饋抑制是提高5-ALA 合成的關鍵。以往研究多集中于從自然界不同宿主中調取ALAS 的同工酶基因，并對其分析比較。隨著酶工程的發展，理性改造技術(借助于生物信息學以及結構生物學的定點突變以及飽和迭代突變等[36])以及非理性改造技術(借助error-prone PCR、DNA shuffling 等[37])已經廣泛應用于酶分子改造。因此，借助以上技術實現ALAS 的分子改造已成為可能。另外，加速5-ALA 的胞外運輸也是研究的一個方向。2)代謝工程改造微生物實現葡萄糖一步發酵合成5-ALA：目前，基于對C4途徑和C5途徑的改造，在無機鹽培養基中一步發酵葡萄糖合成5-ALA已經成為現實。但由于生物體內5-ALA 的合成調控極其復雜，為進一步提高5-ALA 的合成效率，未來相關研究可借助系統生物學手段[38]從基因組水平對5-ALA 的合成途徑進行系統分析，同時利用合成生物學等調控元件和策略[39-40]實現5-ALA 合成途徑中的關鍵基因的精細調控表達[41]以及對工程菌株發酵過程各參數的系統優化，最終實現以葡萄糖為碳源高效合成5-ALA的工業化生產。

[1]Sasaki K,Watanabe M,Tanaka T,et al.Biosynthesis,biotechnological production and applications of 5-aminolevulinic acid.Appl Microbiol Biotechnol,2002,58(1):23?29.

[2]Edwards S,Jackson D,Reynoldson J,et al.Neuropharmacology of delta-aminolaevulinic acid.II.Effect of chronic administration in mice.Neurosci Lett,1984,50(1/3):169?173.

[3]Miyachi N,Tanaka T,Nishikawa S,et al.Preparation and chemical properties of 5-aminolevulinic acid and its derivatives.Porphyrins,1998,7(2/3):342?347.

[4]Burnham BF.δ-Aminolevulinic acid synthase(Rhodopseudomonas sphaeroides).Methods Enzymol,1970,17A:195?204.

[5]Sch?n A,Krupp G,Gough S,et al.The RNA required in the first step of chlorophyll biosynthesis is a chloroplast glutamate tRNA.Nature,1986,322(6076):281?284.

[6]Beale SI.The biosynthesis of δ-aminolevulinic acid in Chlorella.Plant Physiol,1970,45(4):504?506.

[7]Sasaki K,Watanabe K,Tanaka T,et al.5-Aminolevulinic acid production by Chlorella sp.during heterotrophic cultivation in the dark.World J Microbiol Biotechnol,1995,11(3):361?362.

[8]Ano A,Funahashi H,Nakao K,et al.Effect of glycine on 5-aminolevulinic acid biosynthesis in heterotrophic culture of Chlorella regularis YA-603.J Biosci Bioeng,1999,88(1):57?60.

[9]Sasaki K,Ikeda S,Nishizawa Y,et al.Production of 5-aminolevulinic acid by photosynthetic bacteria.J Ferment Technol,1987,65(5):511?515.

[10]Sasaki K,Tanaka T,Nishizawa Y,et al.Production of a herbicide,5-aminolevulinic acid,by Rhodobacter sphaeroides using the effluent of swine waste from an anaerobic digestor.Appl Microbiol Biotechnol,1990,32(6):727?731.

[11]Nishikawa S,Watanabe K,Tanaka T,et al.Rhodobacter sphaeroides mutants which accumulate 5-aminolevulinic acid under aerobic and dark conditions.J Biosci Bioeng,1999,87(6):798?804.

[12]Kamiyama H,Hotta Y,Tanaka T,et al.Production of 5-aminolevulinic acid by a mutant strain of a Photosynthetic bacterium.J Biosci Bioeng,2000,78(2):48?55.

[13]Neidle EL,Kaplan S.5-Aminolevulinic acid availability and control of spectral complex formation in HemAand HemT mutants of Rhodobacter sphaeroides.J Bacteriol,1993,175(8):2304?2313.

[14]Neidle EL,Kaplan S.Expression of the Rhodobacter sphaeroides hemA and hemT genes,encoding two 5-aminolevulinic acid synthase isozymes.J Bacteriol,1993,175(8):2292?2303.

[15]van der Werf MJ,Zeikus JG.5-Aminolevulinate production by Escherichia coli containing the Rhodobacter sphaeroides hemA gene.Appl Environ Microbiol,1996,62(10):3560?3566.

[16]Xie L,Hall D,Eiteman MA,et al.Optimization of recombinant aminolevulinate synthase production in Escherichia coli using factorial design.Appl Microbiol Biotechnol,2003,63(3):267?273.

[17]Fu WQ,Lin JP,Cen PL.5-Aminolevulinate production with recombinant Escherichia coli using a rare codon optimizer host strain.Appl Microbiol Biotechnol,2007,75(4):777?782.

[18]Choi C,Hong BS,Sung HC,et al.Optimization of extracellular 5-aminolevulinic acid production from Escherichia coli transformed with ALA synthase gene of Bradyrhizobium japonicum.Biotechnol Lett,1999,21(6):551?554.

[19]Lee DH,Jun WJ,Shin DH,et al.Effect of culture conditions on production of 5-aminolevulinic acid by recombinant Escherichia coli.Biosci Biotechnol Biochem,2005,69(3):470?476.

[20]Qin G,Lin J,Liu X,et al.Effects of medium composition on production of 5-aminolevulinic acid by recombinant Escherichia coli.J Biosci Bioeng,2006,102(4):316?322.

[21]Liu XX,Wang L,Wang YJ,et al.D-glucose enhanced 5-aminolevulinic acid production in recombinant Escherichia coli culture.Appl Biochem Biotechnol,2010,160(3):822?830.

[22]Fu WQ,Lin JP,Cen PL.Expression of a hemA gene from Agrobacterium radiobacter in a rare codon optimizing Escherichia coli for improving 5-aminolevulinate production.Appl Biochem Biotechnol,2010,160(2):456?466.

[23]Choi HP,Lee YM,Yun CW,et al.Extracellular 5-aminolevulinic acid production by Escherichia coli containing the Rhodopseudomonas palustris KUGB306 hemA gene.J Microbiol Biotechnol,2008,18(6):1136?1140.

[24]Shin JA,Kwon YD,Kwon OH,et al.5-aminolevulinic acid biosynthesis in Escherichia coli coexpressing NADP-dependent malic enzyme and 5-aminolevulinate synthase.J Microbiol Biotechnol,2007,17(9):1579?1584.

[25]Zhang L,Chen J,Chen N,et al.Cloning of two 5-aminolevulinic acid synthase isozymes HemA and HemO from Rhodopseudomonas palustris with favorable characteristics for 5-aminolevulinic acid production.Biotechnol Lett,2013,35(5):763?768.

[26]Fu WQ,Lin JP,Cen PL.Enhancement of 5-aminolevulinate production with recombinant Escherichia coli using batch and fed-batch culture system.Bioresour Technol,2008,99(11):4864?4870.

[27]Lin JP,Fu WQ,Cen PL.Characterization of 5-aminolevulinate synthase from Agrobacterium radiobacter,screening new inhibitors for 5-aminolevulinate dehydratase from Escherichia coli and their potential use for high 5-aminolevulinate production.Bioresour Technol,2009,100(7):2293?2297.

[28]Stephanopoulos G.Metabolic fluxes and metabolic engineering.Metab Eng,1999,1(1):1?11.

[29]Kang Z,Wang Y,Wang Q,et al.Metabolic engineering to improve 5-aminolevulinic acid production.Bioeng Bugs,2011,2(6):342?345.

[30]Kang Z,Geng YP,Zhang YY,et al.Construction of engineered Escherichia coli for aerobic succinate production.Chin J Biotech,2008,24(12):2081?2085(in Chinese).康振，耿艷平，張園園，等.好氧發酵生產琥珀酸工程菌株的構建.生物工程學報,2008,24(12):2081?2085.

[31]Kang Z,Wang Y,Gu P,et al.Engineering Escherichia coli for efficient production of 5-aminolevulinic acid from glucose.Metab Eng,2011,13(5):492?498.

[32]Burkovski A,Kr?mer R.Bacterial amino acid transport proteins:occurrence,functions,and significance for biotechnological applications.Appl Microbiol Biotechnol,2002,58(3):265?274.

[33]Park JH,Lee SY.Fermentative production of branched chain amino acids:a focus on metabolic engineering.Appl Microbiol Biotechnol,2010,85(3):491?506.

[34]Kutukova EA,Livshits VA,Altman IP,et al.The yeaS (leuE) geneof Escherichia coli encodes an exporterofleucine,and the Lrp protein regulatesitsexpression.FEBS Lett,2005,579(21):4629?34.

[35]Livshits VA,Zakataeva NP,Aleshin VV,et al.Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli.Res Microbiol,2003,154(2):123?135.

[36]Reetz MT,Carballeira JD.Iterative saturation mutagenesis (ISM) for rapid directed evolution of functional enzymes.Nat Protoc,2007,2(4):891?903.

[37]Cole MF,Cox VE,Gratton KL,et al.Reconstructing evolutionary adaptive paths for protein engineering.Methods Mol Biol,2013,978:115?125.

[38]Lee SY,Mattanovich D,Villaverde A.Systems metabolic engineering,industrial biotechnology and microbial cell factories.Microb Cell Fact,2012,11:156?158.

[39]Nielsen J,Pronk JT.Metabolic engineering,synthetic biology and systems biology.FEMS Yeast Res,2012,12(2):103.

[40]Nielsen J,Keasling JD.Synergies between synthetic biology and metabolic engineering.Nat Biotechnol,2011,29(8):693?695.

[41]Dueber JE,Wu GC,Malmirchegini GR,et al.Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux.Nat Biotechnol,2009,27(8):753?759.