代謝工程大腸桿菌利用甘油高效合成L-乳酸

田康明，石貴陽，路福平，Suren Singh，王正祥

1 江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122

2 江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫 214122

3 天津科技大學生物工程學院，天津 300457

4 德班理工大學生物工程與食品技術學院應用科學系，南非德班 4001

在石油資源日趨緊張和全球氣候變暖的大背景下，油脂水解產業和生物可降解材料制造業的發展將極大地推動工業制造走向能源綠色化和材料環?；痆1-4]。合理有效地將油脂水解產業副產的甘油用于生物可降解聚乳酸材料前體D-乳酸和L-乳酸的發酵生產，則是推動油脂水解產業和生物可降解材料制造業共同發展的理想選擇之一[1-3,5-6]。

高光學純度L-乳酸的發酵生產在以米根霉、重組酵母或重組大腸桿菌為生產菌株的生產體系中均已實現[7-9]。其中，重組大腸桿菌在甘油代謝利用方面和代謝途徑改善方面的優勢使其更加適合工業化規模下制造極高光學純度的L-乳酸[3]。

作者所在的課題組前期致力于將甘油轉化為極高光學純度D-乳酸的研究，獲得了可高效轉化甘油為D-乳酸的重組大腸桿菌及其配套的發酵工藝[4,10-11]。在此基礎上，通過途徑工程改造，成功構建了可高效利用甘油合成極高光學純度L-乳酸的重組大腸桿菌，研究并建立了配套的發酵工藝。以大腸桿菌為平臺菌株實現甘油到極高光學純度D-乳酸或L-乳酸的高效轉化對于兩種聚乳酸前體的規?；a具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株、質粒和引物列表見表1。相關菌株和質粒均保藏在江南大學中國高校工業微生物資

源和信息中心(CICIM-CU ， http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)。

表1 所用菌株、質粒和引物Table 1 Strains,plasmids and primers in this study

1.2 培養基

LB 培養基[4]，添加瓊脂2%即為固體培養基。發酵培養基[4]：M9培養基添加0.1%的MgSO4母液(1 mol/L)和0.1%的微量元素母液。M9培養基基本組成包括(每升)：15.11 g Na2HPO4·12H2O，3 g KH2PO4，1 g NH4Cl，0.5 g NaCl。微量元素母液包括(每升)：2.400 g FeCl3·6H2O，0.300 g CoCl2·6H2O，0.150 g CuCl2·2H2O ，0.300 g ZnCl2，0.300 g Na2MO4·2H2O ，0.075 g H3BO3，0.495 g MnCl2·4H2O)。LB 培養基和 M9培養基采用121℃蒸汽滅菌20 min，微量元素母液采用0.22μm 的微孔濾膜過濾除菌。

甘油添加量根據不同發酵方式進行確定。

1.3 重組大腸桿菌中L-乳酸合成途徑的構建

參照文獻[12]，對來源于B.coagulans CICIM B1821的L-乳酸脫氫酶結構基因進行克隆，將所克隆的L-乳酸脫氫酶克隆入大腸桿菌D-乳酸脫氫酶編碼基因的啟動子下游。再將表達盒整合到大腸桿菌基因組的lldD 基因中間(圖1)。PCR擴增采用Pfu DNA 聚合酶、PCR 產物純化采用博大泰克的DNA 純化試劑盒。限制性內切酶、DNA 片段的連接參考寶公司(TaKaRa)的產品說明書。質粒的分離參考Qiagen 質粒分離試劑盒的產品說明書。遺傳轉化按照文獻[12]進行，基因整合與抗性篩選標志刪除按照文獻[13]進行。

1.4 發酵實驗

種子平板培養采用LB 固體培養基，37℃靜置培養過夜。

單菌落接種液體LB 培養基。250 mL 三角瓶中分裝50 mL 培養基，37℃、200 r/min 培養12 h 用于菌體收集和接種發酵培養基。

1.4.1 不同溫度下菌體生長性能

取上述菌懸液1 mL，常溫無菌條件下離心收集菌體(8000 r/min，5 min)，收集后的菌體用M9重懸，接種到發酵培養基，接種后初始OD600為0.05。發酵試驗采用250 mL 三角瓶中分裝50 mL 培養基，接種時添加甘油至終濃度5 g/L。接種后，分別在30℃、34℃、37℃、40℃、42℃和45℃條件下200 r/min 搖床培養。每小時測定菌體生長情況直至菌體生長進入穩定期。每個參數設置3個平行試驗，測定結果取平均值。

1.4.2 發酵產酸階段菌體生長特征分析

采用上述菌體生長方式，37℃、200 r/min好氧培養菌體11 h (菌體處于對數生長期中后期)，獲得高活性的菌體；分別在30℃、34℃、37℃、40℃、42℃和45℃條件下150 r/min 搖床培養。補加終濃度50 g/L 的甘油和終濃度75 g/L 的碳酸鈣(用于調節pH)，繼續發酵至22 h。每2 h 測定菌體量、甘油消耗量及乳酸濃度。每個參數設置3個平行試驗，測定結果取平均值。

1.4.3 發酵罐中乳酸發酵實驗

種子培養方式：LB 平板37℃靜置培養過夜后，接單菌落于LB 液體培養基200 r/min、37℃搖床過夜培養。收集菌體后，用M9培養基重懸并接種發酵培養基。500 mL 三角瓶中分裝150 mL 發酵培養基，37℃條件下200 r/min 培養10 h，作為二級種子用于發酵罐接種，接種量為5%。

發酵過程控制：7 L 攪拌式發酵罐，初始裝液量3 L，罐體滅菌(121℃，20 min)。甘油單獨滅菌后分批補加，控制補加后終濃度不高于10%，總添加量根據具體實驗要求確定。發酵過程采用兩階段發酵法[4]，好氧階段發酵溫度37℃，充分供氧控制DO 值不低于30%，采用氨水調節pH 為7.0。菌體量達到OD600值約30即轉入發酵產酸階段。發酵產酸階段采用發酵溫度42℃，低供氧方式，維持恒定攪拌轉速600 r/min，通風量維持3 L/min。25%的Ca(OH)2調節pH 為7.0。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體量的測定

吸取0.5 mL 發酵液于具塞刻度試管中，加0.5 mL 濃度為1 mol/L 的鹽酸將發酵液中過量的CaCO3全部溶解，去離子水定容到所需刻度。以水為空白，于600 nm 處測定OD600值。1.0 OD600相當于0.38 g/L 的細胞干重。

1.5.2 甘油的測定、總乳酸和副產物的測定

甘油濃度采用甘油試劑盒測定(FG0100-1KT；Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，USA)。

高壓液相色譜法測定總乳酸發酵樣品5 mmol/L H2SO4酸化處理后，離心取上清，經10%三氯乙酸沉淀，再次離心，上清液經0.45μm微孔濾膜過濾后，用于高壓液相分析。儀器：dionex p680，Shodex RSpak KC-811；柱溫：50℃；流動相：0.01 mol/L H3PO40.8 mL/min；檢測器：dionex UVD170U；檢測波長：210 nm。

1.5.3 乳酸光學純度的測定

高壓液相色譜法測定乳酸的光學純度。儀器：Dionex p680，Astec CLC-L；柱溫：24℃；流動相：5 mmol/L CuSO41 mL/min；檢測器：Dionex UVD170U；檢測波長：254 nm。

1.5.4 乳酸脫氫酶活性的測定

菌體接種于M9培養基，在37℃、200 r/min培養11 h。用GEMED 細菌總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用GEMED 細菌乳酸脫氫酶(LDH)總活性酶動力比色法定量檢測試劑盒，測定34℃、37℃和42℃條件下的LDH 活力。LDH酶活力單位(U)定義為：在25℃、pH 7.5條件下，每分鐘內轉化1μmol 丙酮酸至乳酸所需的酶量。粗酶液中蛋白含量用Bradford 比色法進行測定。乳酸脫氫酶比活性為粗酶液的乳酸脫氫酶酶活性與蛋白含量的比值，單位為U/μg。

2 結果與分析

2.1 L-乳酸高產菌的構建

2.1.1 ldhA 基因的刪除

以大腸桿菌B0013染色體DNA 為模板，ldhA1和ldhA1為引物，利用PCR 擴增獲得了乳酸脫氫酶基因(ldhA)，將此PCR 產物克隆入pUC19的 EcoRⅠ位點中，獲得重組質粒pUC-ldhA。用PstⅠ酶切去除其中的400 bp 的片段并用T4 DNA 多聚酶將粘性末端補平，再與difGm 片段連接，獲得重組質粒 pUC-ldhA::Gmdif。用EcoRⅠ酶切該重組質粒，獲得乳酸脫氫酶的基因刪除序列，ldhA'-dif-Gm-dif-ldhA，即：ldhA::Gmdif。將此基因刪除序列轉化入E.coli B0013-070。在選擇性培養基上選擇培養出轉化子。再在非選擇性培養基上傳代，篩選出選擇性標記消失的菌株。提取其染色體DNA，用PCR驗證目的基因突變。最終獲得了ldhA 基因突變的突變株B0013-080C，用于后續研究。

2.1.2 BcoaLDH 基因的整合表達及lldD 基因的刪除

運用PCR 技術擴增獲得的BcoaLDH 基因片段克隆入pBlueScript SK(-)的BamHⅠ和EcoRⅠ位點，獲得重組質粒 pSK-BcoaLDH。然后將difGm 片段克隆入重組質粒pSK-BcoaLDH 的SmaⅠ位點。獲得重組質粒 pSK-BcoaLDHdifGm。

以E.coli CICIM B0013染色體DNA 為模板，擴增(引物ldhA1和ldhA2)獲得ldhA 基因的全部啟動子和部分結構區片段，并將片段ldhA克隆入亞克隆載體pUC19的SmaⅠ位點獲得重組質粒pUC-ldhA’。以重組質粒pUC-ldhA’為模板反向擴增(引物RldhA1和RldhA2)獲得線性pUC-ldhA’，并與經BamHⅠ和EcoRⅠ酶切獲得的BcoaLDH-difGm 片段連接，獲得重組質粒pUC-PldhA-BcoaLDH-difGm。該重組質粒包含了294 bp 的ldhA 基因啟動子序列片段和170 bp 的BcoaLDH 基因的結構基因序列。

編碼FMN 為輔酶的L-乳酸脫氫酶基因的結構基因lldD 基因，被選定為BcoaLDH 基因整合在重組菌染色體上的目標基因。該過程可以同步實現L-乳酸分解形成丙酮酸代謝途徑的阻斷和外源L-乳酸合成途徑的引入。首先通過PCR 擴增(引物lldD1和lldD2)獲得lldD 基因片段，并將該片段克隆入亞克隆載體pMD18T-simple 的EcoRⅤ位點獲得重組質粒 pMD-lldD。然后將PldhA-BcoaLDH-difGm 片段克隆入重組質粒pMD-lldD 的BamHⅠ和EcoRⅠ位點。獲得重組質粒pMD-lldD::PldhA-BcoaLDH-difGm。純化表達突變盒lldD::PldhA-BcoaLDH-difGm 片段，電擊轉化其入菌株 B0013-080C，篩選獲得重組菌株B0013-090B (B0013,Δack-pta,Δpps,ΔpflB,Δdld,ΔpoxB,ΔadhE,ΔfrdA,ΔldhA,ΔlldD::PldhABcoaLDH-dif)(圖1)，再經過培養傳代，刪除其中的抗生素選擇性標記。

2.2 菌株090B 生長特征

乳酸合成過程與菌體生長過程存在相互競爭的關系，甘油作為碳源用于乳酸的發酵生產過程中這一矛盾尤為突出[14]。構建L-乳酸合成途徑的過程中如何兼顧對L-乳酸合成過程的階段性調控是實現甘油高效轉化為L-乳酸關鍵。

圖1 ldhA 啟動子替換BcoaLDH 基因自身啟動子并將其整合在大腸桿菌染色體上的lldD 基因的部分序列Fig.1 Sketch map of BcoaLDH gene expressed under the downstream of ldhA promoter.The genetic screening marker of difGm gene was cloned into the upstream of ldhA promoter.Then the mutant cassette was placed between the two homologous arms of lldD gene.

在引入了嗜熱菌的L-乳酸脫氫酶基因的同時組建了大腸桿菌原有D-乳酸脫氫酶基因啟動子調控下的L-乳酸脫氫酶表達盒，獲得了重組菌090B。首先在30℃～45℃條件下確認菌株090B的最適菌體生長溫度，結果如圖2A 所示。在37℃下表現出最優的生長性能。因此選擇37℃培養溫度為菌體生長的最適溫度。

前期的研究顯示，菌株090B 的親本菌株070最適生長溫度為34℃[10]。這一改變的機理尚不清楚?？赡艿脑蚴?，在D-乳酸脫氫酶合成途徑被阻斷的背景下，37℃條件下嗜熱菌來源L-乳酸脫氫酶酶活力相對較低(圖2B)，有助于減輕生長階段L-乳酸的合成對菌體生長所需丙酮酸的競爭。這方面的詳細機理有待進一步研究。

2.3 發酵階段適度提升發酵溫度更利于L-乳酸的合成

與甘油合成D-乳酸的過程相似，甘油為碳源合成L-乳酸的發酵過程同樣需要通入適量氧氣用于保證甘油代謝過程的順利進行[4,10]。氧氣的存在必然會導致細胞在產酸階段繼續生長而競爭用于合成L-乳酸的丙酮酸。因此，考察了提高產酸階段發酵溫度對L-乳酸合成的影響。如圖3所示，42℃條件下，菌體生長受到發酵溫度提高的限制，而L-乳酸積累量和得率均在42℃條件下獲得了最高值?？梢?，引入了嗜熱菌的L-乳酸脫氫酶后，菌株090B 在42℃條件下表現出了最優的產酸性能。因此選擇42℃培養溫度為發酵產酸階段的最適溫度。

此外，對發酵液中乳酸的光學構型分析顯示，其L-乳酸的光學純度均高于99.9%?？梢?，ldhA 基因的敲除有效阻斷了D-乳酸的合成途徑。

2.4 變溫工藝下重組菌合成L-乳酸的效率得到顯著提升

在7 L 發酵罐中，細胞生長階段使用37℃培養，發酵產物形成階段使用42℃培養。如圖4所示，發酵27 h，積累L-乳酸132.4 g/L，產酸強度4.90 g/(L·h)。其L-乳酸的光學純度達到99.95%。低供氧發酵產酸階段甘油到乳酸的得率為93.7%。成功實現了甘油到L-乳酸的高效轉化。

圖2 不同溫度下E.coli B0013-090B 的生長特征和乳酸脫氫酶活性Fig.2 Growth and L-LDH activity of B0013-090B under different temperatures.(A) Cell growth.(B) L-LDH activity.

圖3 發酵產酸階段不同發酵溫度下E.coli B0013-090B 菌體量積累和乳酸生成Fig.3 Biomass accumulation and L-lactate production of E.coli B0013-090B during the fermentation phase under different temperature.(A) Cell growth.(B) L-lactate accumulation.

圖4 變溫工藝下重組菌在7 L 發酵罐中的生長和產酸情況Fig.4 Cell growth and L-lactate production of E.coli B0013-090B using temperature-switched fermentation process.The arrow indicates the time when the culture was switched from the aerobic cultivation at 34°C to the microaerobic production phase at 42°C.○:glycerol;■:L-lactate;●:acetate;▲:succinate;□:pyruvate;△:cell mass.

在菌株090B 中，通過引入嗜熱菌的L-乳酸脫氫酶，在細胞生長溫度條件下，L-乳酸脫氫酶的活性處于較低水平(圖2)，細胞生成過程因為L-乳酸合成的減少而得到顯著改善。

解決了細胞生長的問題后，如何恢復或增強L-乳酸的合成強度便成了產酸階段的首要問題。在引入來源于嗜熱微生物的L-乳酸脫氫酶后，發酵溫度的提高可更好地讓重組的L-乳酸脫氫酶發揮作用(更接近于其最適作用溫度)，進而促進L-乳酸的生物合成。另外由于L-乳酸脫氫酶的轉錄和表達過程在細胞生長階段后期便已經開始，因此發酵溫度升高后前期積累的丙酮酸也主要流向L-乳酸的合成(圖4)。

清華大學的劉德華教授研究團隊首次報道了野生大腸桿菌利用甘油合成D-乳酸的情況[2]。美國Rice 大學的Mazumdar 等通過對大腸桿菌甘油代謝利用途徑的增強和D-乳酸合成競爭途徑的阻斷成功構建了利用甘油同型合成D-乳酸的重組大腸桿菌[15]。作者所在的課題組前期通過建立兩階段發酵工藝，并引入溫度開關控制策略，實現了甘油到D-乳酸的高效轉化[10]。

盡管多個L-乳酸脫氫酶基因在大腸桿菌中成功表達，但是相關菌株的L-乳酸合成途徑沒有得到合理的改造[5,16]。因此，獲得的相關菌株不具備工業應用價值。在前期構建的D-乳酸高產菌株的基礎上，通過引入嗜熱菌的L-乳酸脫氫酶并采用發酵工業生產過程中溫度調控這一主要控制因素，技巧性地實現了L-乳酸生產菌種與發酵工藝控制間的協調與聯動，實現了L-乳酸在保證其最高光學純度與化學純度的前提下的高效合成。構建獲得的L-乳酸高產菌株090B，在甘油代謝利用和乳酸合成方面均表現出了優異的性能，這主要歸因于以下三點。其一，引入的L-乳酸脫氫酶在正常的培養溫度下酶活力較低，更有利于獲得高活性的菌體。其二，菌株090B在細胞生長階段不僅僅完成了高活性菌體的積累，丙酮酸的后期積累和L-乳酸脫氫酶在生長階段后期的表達都為產酸階段的高效催化提供了動力儲備，有助于發酵產酸階段L-乳酸脫氫酶活性的快速啟動和乳酸的快速合成。其三，發酵溫度提高后，菌體生長受到了有效限制。丙酮酸主要甚至全部流向L-乳酸，保證了甘油到L-乳酸的轉化效率。

最近，美國Rice 大學的Mazumdar 等報道了在構建代謝利用甘油合成L-乳酸的重組大腸桿菌研究所取得新的進展[17]。他們一方面刪除L-乳酸分解代謝相關基因，另一方面表達了來源于牛鏈球菌Streptococcus bovis 的L-乳酸脫氫酶，用于L-乳酸的合成。再則他們通過敲除mgs 基因阻斷了大腸桿菌中可能形成消旋乳酸發酵的所謂“甲基乙二醛支路”。由此可以理論轉化率的93%形成光學純度99.9%和化學純度97%的L-乳酸(實際底物轉化率為89.3%)[17]。同時可以看出，84 h 的發酵周期顯示此研究成果未能突破已有研究成果，也不太可能為工業化過程所采納。

另外，已有的研究顯示，甜菜堿的添加有助于提高菌株代謝利用葡萄糖和合成D-乳酸的效率，但同時會降低D-乳酸的光學純度[18]。原因是甜菜堿減輕滲透壓對細胞生長和代謝的不利影響的同時增強了丙酮醛為底物合成L-乳酸的途徑，因此敲除mgs 基因有助于提高甜菜堿添加情況下的D-乳酸光學純度[19]。在不添加甜菜堿的發酵過程中，保留mgs 基因則同樣可以實現高光學純度D-乳酸的合成[20-21]。菌株090B 發酵獲得高光學純度L-乳酸的結論，也證實重組菌在沒有敲除mgs 基因的遺傳背景下，可以在不添加甜菜堿的無機鹽培養基中合成光學純度高于99.9%的L-乳酸。

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