Her-2基因特異性核酶體外表達載體的建立

麻馨月 趙 雪

(吉林農業科技學院生物工程學院，吉林 吉林 132101)

Her-2基因特異性核酶體外表達載體的建立

麻馨月 趙 雪

(吉林農業科技學院生物工程學院，吉林 吉林 132101)

目的構建人表皮生長因子受體-2(HER-2)特異性核酶(ribozyme，RZ)體外表達載體的建立。方法設計合成RZ基因，將該RZ克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，測序鑒定。結果經DNA測序分別證實合成的RZ基因序列克隆入pcDNA3.1(+)中。結論構建HER-2特異性RZ真核表達載體有助于進一步研究RZ對靶基因切割作用及雌激素受體陰性乳腺癌細胞MDA-MB-453中HER-2信號轉導.

人表皮生長因子受體-2(HER-2)；核酶

雌激素受體陰性乳腺癌惡性程度比較高，對內分泌治療具有效率低，易轉移復發，預后較差，生存率較低等特點，因而成為研究的熱點和難點問題之一[1]。在雌激素受體陰性乳腺癌中，人表皮生長因子受體-2(HER-2)[2-4]常常呈現高表達狀態，進行雌激素受體陰性乳腺癌HER-2及其相關因子的研究，有助于確定HER-2在雌激素受體陰性乳腺癌細胞生長、增殖及乳腺癌從激素依賴型轉變為非激素依賴型中的作用，尋找可能的治療靶點。本研究根據HER-2基因序列，設計并合成核酶基因，構建HER-2基因特異性錘頭狀核酶真核表達載體，為檢測該核酶在體外對靶基因HER-2的作用，研究雌激素受體陰性乳腺癌細胞中HER-2信號轉導途徑相關因子的相關性及其分子機制和HER-2作為腫瘤基因治療靶點提供實驗與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內切酶、DNA連接試劑盒、質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自Takara公司；MDA-MB-453細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；RPMI-1640培養基、DEPC、Trizol總RNA提取劑為Invitrogen公司產品；體外轉錄試劑盒為promage公司產品。

1.2 方法

1.2.1 核酶的設計

用計算機人工設計HER-2特異性核酶。選擇HER-2mRNA基因序列(NM-004448)第2502位點的GTT為核酶切割位點，在核酶基因序列兩端分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶位點及保護堿基。以核酶基因的非模板鏈為HA鏈，模板鏈為HB鏈，經設計后的核酶基因序列共58bp。

HA鏈：5'-GCGGAATTCTTTCCCTCCTGATGAG

TCCGTGAGGACGAAACACTTTGATGGATCCCGC-3'；

HB鏈：5'-GCGGGATCCATCAAAGTGTTTCGTC

CTCACGGACTCATCAGGAGGGAAAGAATTCCGC-3'。

1.2.2 核酶基因的合成

設計核酶基因HA鏈和HB鏈，并由上海生物工程技術服務有限公司合成，取50μL A、B鏈混合經95℃加熱變性5min，逐漸冷卻到室溫，退火形成互補雙鏈，命名為RZ基因。

1.2.3 核酶基因重組子的構建及鑒定

RZ基因與pcDNA3.1(+)載體EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切消化，并經凝膠回收。將RZ基因和pcDNA3.1(+)載體按摩爾比10∶1混合進行連接反應后，轉化入大腸桿菌JM109，挑取單個菌落提取質粒，應用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切初步鑒定，DNA測序鑒定重組子。

1.2.4 核酶靶基因HER-2重組子的構建及鑒定

MDA-MB-453細胞懸浮生長于10%小牛血清的RPMI-1640培養基中(含100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素)， 37℃，在體積分數為5%的CO2中培養。Trizol試劑提取細胞總RNA。利用PrimerPremier 5軟件設計引物。上游引物：5'-GAATTCCGGCACAGTCTACAAGGGCATC-3'；下游引物：5'-GGGGTACCCCAGGCGTCCGCGGTTT-3'。RT-PCR擴增靶基因HER-2 cDNA片段，也將其插入載體pcDNA3.1(+)，重組子經PCR反應后電泳及測序鑒定。

2 結 果

核酶基因真核表達載體的鑒定：

2.1 酶切鑒定

應用BamHⅠ，EcoRⅠ雙酶切載體，室溫，2.0%瓊脂糖凝膠，80V，電泳30min。電泳未見到＜100bp的小片段。結果見圖1。

2.2 核酶基因真核表達載體DNA測序鑒定

將構建出的載體進行DNA測序分析，由上海生物工程公司測定。所合成的核酶基因序列正確，并已被準確地克隆入pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點之間，該序列于T7啟動子的下游。結果見圖2。

3 討 論

核酶是一類具有催化活性的RNA分子，本實驗采用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶能與特異性的HER-2靶基因結合，并且能切割HER-2靶基因，因此具有較強的抑制效率。錘頭狀核酶分子較小，結構簡單，其催化活性中心只含有13個保守序列，加上兩端與靶基因結合的結合臂，即組成了與靶基因GUC序列結合的具有催化活性的核酶，廣泛應用于基因治療領域[5-8]。由于核酶的本質是RNA，在細胞內不穩定，易被細胞內的RNA酶降解，本實驗構建穩定而高表達的核酶載體成為發揮核酶較強抑制效率的首要步驟。所構建核酶的靶基因載體，在體外檢測RZ活性及最佳反應條件，能增大其在體內發揮作用的可能性，保證為催化切割靶基因提供基本條件。

本實驗RZ切割位點是根據畢鋒等[9]設計的HER-2特異性核酶切割位點設計的，在基本核酶序列兩端加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，定向插入pcDNA3.1(+)載體的T7啟動子下游，這樣核酶基因既能在真核細胞中表達又能在原核細胞中表達，便于核酶基因的擴增及細胞轉染的研究。本實驗構建的RZ表達載體，結果有效表達，可用于后續的體外轉錄及體外切割活性實驗，以便提供核酶的體外切割活性及最適反應條件，為下一步研究核酶在細胞內發揮較強抑制作用提供了可能性。

圖1 核酶載體的鑒定

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[3] 楊金巧,陳琳,幸天勇,等.乳腺癌中C-erbB2癌基因與雌、孕激素受體和PS2的關系及其預后意義[J].四川大學學報:醫學版,2004, 35(3): 334-336.

[4] Suzuki T,Anderegg B.Adenovirus-mediated Ribozyme Targeting of HER-2/neu Inhibits in Vivo Growth of Breast Cancer Cells[J]. Gene Ther,2000,7(3):241-248.

圖2 核酶重組載體DNA序列分析

[5] 石建林,章為,周雪.核酶技術簡介[J].四川解剖學雜志,2002,10 (1): 25-29.

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[9] 畢鋒,張學庸,樊代明,等.抗c-erbB-2Ribozyme的計算機設計[J].第四軍醫大學學報,1997,18(1): 6-9.

R3

B

1671-8194（2013）17-0080-02

吉林農業科技學院青年教師科研基金資助項目{趙雪：吉農院合字[2012第123號]；麻馨月：吉農院合字[2012127]號}