黑脈羊肚菌多酚氧化酶特性研究

張 琦，吳素蕊，樊 建，*，趙天瑞，張 麗

(1.昆明理工大學化學工程學院，云南昆明 650500;2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明 650223)

黑脈羊肚菌(M.angusticepes)又稱小尖羊肚菌，隸屬于子囊菌門 (Ascomycota)、盤菌綱(Pezizomycetes)、盤 菌 目 (Pezizales)、羊 肚 菌 科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)，是野生名貴食藥用菌［1］。因其菌蓋表面呈許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名。黑脈羊肚菌因其具富含多種對人體有益的營養成分，野生生長污染少且產量稀少而受到人們喜愛。中醫認為其性平，味甘寒，無毒，具有益腸胃、消化助食、化痰理氣、補腎、壯陽、補腦、提神之功能［2］。羊肚菌研究多見于多糖，菌絲及無機元素等。然而，黑脈羊肚菌采摘后在加工和貯藏期間極易變色，目前有關黑脈羊肚菌多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO，EC1.10.3.1)的研究報道很少，僅見袁江蘭等對羊肚菌的多酚氧化酶研究［3］，國外Cavazzoni V［4］等測定羊肚菌中有羧甲基纖維素酶(CMCase)，微晶纖維素酶(Avase)，β－葡萄糖苷酶。Kamal S［5］測定了尖頂羊肚菌、粗腿羊肚菌和羊肚菌中β－葡萄糖酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶等的含量。Bisakow ski B［6］等將羊肚菌的粗提取物用硫酸銨沉降得到脂肪氧合酶。缺乏針對黑脈羊肚菌PPO特性與褐變的相互關系方面的研究。本文主要研究在黑脈羊肚菌的加工貯藏過程中能夠誘發其酶促褐變的多酚氧化酶在不同環境體系中的活力變化，探索其與黑脈羊肚菌褐變的關系，為合理利用這一資源，科學控制深加工過程中的酶促褐變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑脈羊肚菌子實體 由昆明食用菌研究所提供;石英砂、鄰苯二酚、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等 均為分析純，購自天津致遠化學儀器有限公司。

TGL－16G冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;HH－2恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;TV－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;AL204電子天平 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;PHS－3C Precision pH/mv Meter pH計 杭州奧龍儀器有限公司

1.2 測定方法

1.2.1 PPO粗酶液的提取 采用磷酸鹽緩沖液提取法［7］。將黑脈羊肚菌子實體切成小塊，準確稱取5g置于研缽中，加少許石英砂和10mL預冷過的0.2mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液，冰浴研磨勻漿，六層紗布過濾，用6mL磷酸緩沖液沖洗研缽及玻璃棒3次，合并洗滌液，在4℃下12000r/min離心20min，上清液即為粗酶液。4℃保存，待測。

1.2.2 PPO的酶活性測定 在比色皿中順次加入pH7.0磷酸緩沖液2mL，0.1mol/L鄰苯二酚0.5mL，加入0.5mL酶液后迅速在420nm下測定吸光值，并記錄反應1min后的吸光值(反應時間內光密度變化)。以0.5mL磷酸緩沖液代替鄰苯二酚，并加入等量粗酶液為對照。以每分鐘引起吸光值改變0.001所需的酶量為一個酶活單位［8］。結果表示為 U·g－1。

1.2.3 PPO催化反應的速度曲線 在比色皿中順次加入 pH7.0磷酸緩沖液2mL，0.1mol/L鄰苯二酚0.5mL，加入0.5mL酶液后迅速測定，酶液加入后開始計時，每30s記錄1次吸光值隨時間的變化的值，連續記錄5min。

1.2.4 溫度對PPO活性的影響 分別于20、30、40、50、60、70、80、90℃下將 pH7.0 磷酸緩沖液，0.1mol/L鄰苯二酚底物液保溫5min至相應溫度，按1.2.2方法進行測定。

1.2.5 pH對PPO活性的影響 分別配制pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的磷酸緩沖液，在 30℃ 下，按1.2.2方法進行測定。

1.2.6 底物濃度對PPO活性的影響 酶濃度一定，分別配制 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mol/L濃度的鄰苯二酚，于30℃，按1.2.2方法進行測定。根據 Lineweaver和 Burk的方法1/V對1/［S］做雙倒數函數圖求得米氏常數(Km)和最大速度(Vmax)值。

1.2.7 抑制劑對PPO活性的影響 分別配制10、20、30、40、50mg/mL 濃度的檸檬酸，1、2、3、4、5mg/mL 濃度的亞硫酸氫鈉和抗壞血酸，在比色皿中順次加入pH7.0磷酸緩沖液2mL，0.1mol/L鄰苯二酚0.5mL，抑制劑0.5mL，加入0.5mL酶液后在波長420nm下迅速測定。

1.3 數據處理

每次測定重復測定三次，分別平行取樣，結果以平均值計算。數據處理使用Excel。

2 結果與討論

2.1 PPO催化反應的進程曲線

我很生氣，對猴子產生了感官上的厭惡，便對站長說：“好了，你休息吧！我們走了，如果有事，到前邊辦公室找我們?！蔽艺f著，從窗口指了指前面農科站的房間。

以反映時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作反應進程曲線［9］。由圖1可以看出，隨反應時間延長，單位時間內產物生成量在減少，也就是酶促反應速度在逐漸減小。但在1min以內的產物生成量與反應時間近似呈線性關系，基本能反映酶促反應的初速度，同時，時間也能滿足實驗操作的需要，所以測定選用酶促1min時的吸光值來表示酶活性高低。

2.2 溫度對PPO活性的影響

圖1 PPO反應進程曲線Fig.1 The reaction curve of PPO

PPO是一種蛋白質，過高的溫度會破壞其活性部位三維結構的完整性，而三維結構又是保持酶活力的關鍵［10］。溫度對PPO活性有雙重影響，一是溫度升高加快酶催化反應速度;二是促使酶蛋白變性，這是兩種對抗反應的綜合反應［11］。不同溫度下黑脈羊肚菌PPO活力變化見圖2?？梢钥闯龊诿}羊肚菌PPO的最適溫度在30℃，與多數報道PPO最適宜溫度是25～30℃的結果一致［12］。進一步提高反應溫度，PPO的活力不斷下降，下降明顯，90℃時活力下降60%，為7.98U·g－1，因此可以通過熱處理使黑脈羊肚菌PPO鈍化。

圖2 溫度對PPO活力的影響Fig.2 Effect of the temperature on the activity of PPO

2.3 pH對PPO活性的影響

由圖3可知，pH是影響PPO活性的重要因素?？梢钥闯龊诿}羊肚菌PPO的最適pH為7.5，高于或低于該值酶活性都有明顯下降，在pH6.5、7.5前活力呈現上升趨勢，pH超過7.5后活力開始下降，在pH7時酶活下降可能是由于同工酶分子上活性基團的解離狀態不適于與底物結合。其PPO活性的影響因素可能有提取部位、提取分離方法、測定酶活力時所采用的底物和緩沖液等。最可能導致下降的原因是一些果蔬中的多酚氧化酶具有很多同工酶或多種分子形式。

圖3 pH對PPO活性的影響Fig.3 Effect of the pH on activity of PPO

2.4 底物濃度對PPO活性的影響

圖4 PPO酶促反應Lineweaver－Burk圖Fig.4 Lineweaver－Bulk of PPO Enzymatic reaction

由此說明，黑脈羊肚菌PPO酶促褐變反應動力學符合米氏方程，它的物理意義是酶反應達到Vmax一半時的底物濃度，它與酶的性質有關，與酶的含量無關［13］。底物過量時，多酚氧化酶活性隨其加入量增大而增大，但底物飽和時，其活性增加減慢直到飽和。

2.5 抑制劑對PPO活性的影響

不同濃度的檸檬酸、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸抑制劑對黑脈羊肚菌PPO的抑制作用見圖5～圖7。

圖5 不同濃度檸檬酸對PPO活力的影響Fig.5 Effect of citric acid on the PPO activity

圖6 不同濃度亞硫酸氫鈉對PPO活力的影響Fig.6 Effect of NaHSO3on the PPO activity

圖7 不同濃度抗壞血酸對PPO活力的影響Fig.7 Effect of ascorbic acid on the PPO activity

三種抑制劑均對PPO有抑制作用。亞硫酸氫鈉和抗壞血酸濃度為5mg/mL時，PPO活力均能降至4.5U·g－1左右，較之適宜條件下最高活性下降了77.5%。且抗壞血酸在低濃度下就有比較好的抑制效果。檸檬酸抑制作用較其他兩種抑制劑弱，濃度大50mg/mL時，PPO活力下降了70.5%。抑制作用強弱順序為抗壞血酸＞亞硫酸氫鈉＞檸檬酸。究其原因可能是抗壞血酸一方面抑制了多酚氧化酶本身的催化作用，同時又能還原PPO形成的產物醌為酚，并且還能消耗反應體系中的氧。亞硫酸鹽通?？捎糜诜乐姑复俸肿冏饔每梢越忉尀閹讉€機制。一個是O－醌反應。形成醌亞硫酸鹽復合物，防止醌聚合。亞硫酸鈉的進一步反應直接針對PPO有關的酶的結構，導致多酚氧化酶失活［14］?？梢?，使用適當濃度的抑制劑來抑制PPO的活性是控制酶促褐變的有效途徑之一。

3 結論

3.1 黑脈羊肚菌PPO的最適溫度在30℃，溫度超過50℃后酶活性開始明顯下降，不耐高溫。溫度變化對黑脈羊肚菌PPO影響較大。

3.2 黑脈羊肚菌PPO的最適pH為7.5。酸性條件下pH波動不大，較為穩定。

3.3 黒脈羊肚菌PPO酶促反應動力學符合米氏方程，根據直線斜率和截距可求得該反應的米氏常數Km值為 0.4769mol·L－1，最大反應初速度 Vmax為1.901mol·L－1。相應的黑脈羊肚菌PPO動力學方程

3.4 常見抑制劑檸檬酸、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸對黒脈羊肚菌PPO均有抑制作用，抑制效果以抗壞血酸最好，亞硫酸氫鈉次之，檸檬酸最弱。亞硫酸氫鈉和抗壞血酸濃度為5mg/mL時，PPO活力較之適宜條件下最高活性下降77.5%。檸檬酸濃度大50mg/mL時，PPO活力下降70.5%。

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