甘蔗黃葉病毒實時熒光RT-PCR檢測體系研究

王洪星，龔 殿，張雨良，王健華，劉志昕

（中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業部熱帶作物生物技術重點開放實驗室，海南 ?？?71101）

甘蔗黃葉?。ㄔ缙诜Q甘蔗黃葉綜合癥）于20世紀80年代末首先報道在美國夏威夷發生，90年代初在巴西造成嚴重危害，目前幾乎已擴散至世界各產蔗國。該病的癥狀常出現在植株生長的中后期，在干旱條件下癥狀表現早而明顯，造成感病品種嚴重減產[1-3]。其病原ScYLV屬于黃癥病毒科（Luteroviridae）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus），病毒粒體球形，直徑22～24 nm，在寄主體內含量很低，僅分布于韌皮部篩管伴胞細胞質中。Lockhart[4]首先利用電子顯微鏡在感病植株葉片韌皮部伴胞細胞質中觀察到多面體ScYLV粒體；隨后利用抗血清技術檢測該病毒；Schenck[5]利用組織印跡雜交免疫法（TBIA）檢測ScYLV；Comstock[6]采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定方法（DAS-ELISA）進行病原檢測。王伯輝等[7]在廣西觀察到甘蔗黃葉病并對其病原進行了初步的檢測，許東林等[8]報道了發生在廣東蔗區的ScYLV分子鑒定結果。與目前使用的生物學鑒定、血清學檢測和逆轉錄-聚合酶鏈式反應RT-PCR等ScYLV檢測技術相比，實時熒光PCR技術不但靈敏度高于傳統PCR，而且能對病原體的數量進行精確定量。SYBR Green I染料法具有靈敏度高、信噪比高、適用范圍廣和低價等特點。在核酸的實時檢測方面有很多優點，由于它與所有的雙鏈DNA相結合，不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低，可提高ScYLV的檢測效果。我們進行了ScYLV的實時熒光RT-PCR檢測技術研究，以期建立一種快速、準確、靈敏和簡便的檢測ScYLV的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為經檢測感染了甘蔗黃葉病毒和高粱花葉病毒的植株，甘蔗感病材料采自海南省紅毛鎮甘蔗種植基地。

主要試劑和儀器：Mx3005型熒光定量 PCR儀、TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒、RT-PCR試劑盒PrimeScript TM One-Step Ver.2.0購自寶生物工程（大連）有限公司，Taq酶及其它生物試劑均購自北京全式金生物科技有限公司，其它藥品為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 總核酸的提取 從待檢測甘蔗植株上取幼嫩組織，以TRIzol法[9]提取RNA樣品。

1.2.2 引物設計與合成 選取在GenBank上 （登錄號AF369923.1、AF369924.1、AF369925.1、AF369926.1、AF369927.1、AF369928.1、AF369929.1、AF141385.1、AF141385.1）登錄的 9 個 ScYLV 分離物高度保守的衣殼蛋白基因序列中，運用Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN進行基因同源性分析和引物設計。引物由上海生工生物技術有限公司合成[10]。

1.2.3 RT-PCR 以所提取病樣的總RNA為模板，以oligodT為反轉錄引物，進行RT-PCR反應。PCR反應體系為25μL，反應成分包括ScYLV CDNA2μL、10 pm/μL 上游引物 s-pf 1μL、10pm/μL 下游引物 s-pr1μL，10mM dNTP2 μL、Taq 酶 0.2μL、無菌水18.8μL。 PCR擴增程序為：94℃預變性 3 min，95℃變性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環35次；最后72℃延伸10 min。取10μL PCR產物與lμL染料相混合，在室溫下進行1.2%瓊脂糖恒壓凝膠電泳。PCR產物利用純化試劑盒進行切膠純化。

表1 用于實時定量PCR擴增的引物特征

1.2.4 重組質粒的構建、篩選、鑒定與稀釋 按照PMD19-T-Vector試劑盒的操作說明將PCR產物與PMD19-T載體進行連接，重組質粒轉化大腸桿菌Trans-CD201感受態細胞。從已轉化的大腸桿菌細胞中提取重組質粒，操作按照Axygen公司的質粒小量抽提試劑盒進行，用菌液PCR法對重組質粒進行鑒定；將鑒定為陽性克隆的質粒進行測序分析。同時用紫外分光光度計測定其濃度為1.16 μg/μL，按照公式CN=M×N/L×D計算其拷貝數。CN為質?？截悢?，M為檢測到的核酸最小濃度，N為Avgadro's number（6.022×l023molecules/mol）；L為核酸長度（質?？傞L+插入目的片段長度，單位為kb），D為從1kb核酸轉化到道爾頓轉化因子（dsDNA=6.6×l05）。經計算，得質粒的拷貝數為6.0×109拷貝/μL。加入滅菌水以10倍為梯度將重組質粒依次稀釋，放入-20℃冰箱備用。

1.2.5 引物濃度的優化和退火溫度的優化 以200nM、400nM、600nM、800nM四個引物濃度梯度進行篩選；然后以優化的引物濃度，以6×109拷貝/μL到6×102拷貝/μL的重組質粒為模板，選取56℃到62℃的10個不同退火溫度進行實時定量PCR反應，每個梯度設置兩個重復，觀察不同梯度引物濃度、不同退火溫度對熒光信號的影響。同時在最優的反應體系和條件下反應，獲得標準曲線。

1.2.6 特異性測試與重復性測試 選取感染高粱花葉病毒植株樣品和健康植株樣品的總核酸與ScYLV總核酸，在相同體系和條件下進行擴增，觀察熒光信號的變化；同時通過批內和批間重復性測試，驗證檢測體系的穩定性。批內重復性測試是通過對不同濃度的標準品重復測定3次，批間重復性測試是連續3d對同一標準品進行檢測，通過測得的標準差進而計算CV值。

1.2.7 線性范圍測試 以100倍梯度稀釋的6×108拷貝/μL到6×101拷貝/μL的重組質粒為模板，在上述優化的體系進行實時定量PCR反應，通過觀察熒光信號的變化和r2值的大小，確定該體系的線性范圍。

1.2.8 靈敏性測試的對比試驗 分別對己知濃度的ScYLV標準品10倍梯度稀釋，以此為模板分別進行實時定量PCR反應和普通PCR反應，驗證所建立的檢測方法的靈敏性。

1.2.9 田間樣品檢測 利用已建立的方法對來自田間的13份疑似樣品進行實時定量PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 目的片段擴增

利用RT-PCR法擴增獲得的ScYLV CP基因的插入用目的片段，特異性PCR產物片段長度與預計目的片段大小基本一致（圖1）。

圖1 RT-PCR法擴增ScYLVCP基因的插入用目的片段

2.2 ScYLV目的基因重組質粒PCR鑒定結果

鑒定結果如圖2：獲得目的片段與預期大小相符，經測序、blast分析，所插入目的片段正確，大小為189bp，說明重組質粒構建成功。

圖2 PCR檢測重組質粒

2.3 最佳引物濃度篩選結果

通過觀察熒光信號的變化可看出各個不同的引物濃度對擴增曲線的影響不是很大，但是當引物濃度為600nM時，熒光擴增曲線最平滑，熒光值最高，呈典型“S”型形狀，平行管測定其重復性較好，且其Ct值也比其他組要小，說明其擴增效率及檢測靈敏度比其它組高，確定引物濃度為600nM時，反應較穩定，曲線平滑，只有單一的峰，無非特異性擴增，為該體系的最佳引物濃度（見圖3）。

圖3 引物濃度為600nM時的融解曲線圖

2.4 退火溫度的優化結果

通過觀察不同退火溫度下擴增曲線，看出該反應在62℃到52℃之間的溫度變化不敏感，熒光信號均有增加，但是在58℃時PCR擴增效率最好，因此確定58℃為該體系的最佳退火溫度（圖4，圖5）。

圖4 58℃退火溫度下的擴增曲線圖

圖5 58℃退火溫度下的標準曲線圖

2.5 特異性測試結果

圖6顯示：該體系只針對ScYLV樣品進行了擴增，對測試的SrMV和健康甘蔗樣品都沒有熒光曲線的擴增，表明引物特異性好。

2.6 線性范圍測試結果

通過對一系列100倍梯度稀釋的ScYLV標準品重組質粒進行實時定量PCR反應，并觀察熒光信號的變化，可以看出當標準品的濃度為 6×108拷貝/μL 到 6×101拷貝/μL 時，標準曲線有良好的相關性，可以檢測的線性范圍為6×l01～6×108拷貝（圖7）。

圖6 體系特異性檢測結果

圖7 標準曲線線性苑圍

圖8 實時定量PCR檢測不同濃度的ScYLV重組質粒1～8：6×108，6×107，6×106，6×105，6×104，6×103，6×102，6×101拷貝/μL 9：負對照

圖9 普通PCR檢測不同濃度的ScYLV重組質粒泳道 l～8：6×108，6×107，6×106，6×105，6×104，6×103，6×102，6×101拷貝/μL 9：負對照

2.7 靈敏性測試的對比試驗

結果表明，實時定量PCR能夠檢測到6×100拷貝/μL重組質粒，而常規PCR只能檢測到6×102拷貝/μL重組質粒，實時定量PCR檢測的靈敏度比常規PCR提高了100倍（圖8、9）。

圖11 田間樣品檢測擴增曲線

2.8 重復性測試結果

對濃度高低不同的標準品重復測定3次和連續3d對同一標準品進行檢測，通過計算獲得該體系的批內CV值為1.6%，批間CV值為3.2%，小于5%，說明重復性較好（圖10）。

表2 田間ScYLV分離株的實時熒光RT-qPCR檢測結果

2.9 田間樣品測試

適用性檢測結果：由表2、圖11可以看出，對來自田間受ScYLV不同致病力（強、弱和中等）感染的株系，該體系均可以進行穩定擴增和定量檢測，因而可以作為一種適宜的定量和定性檢測手段來研究甘蔗黃葉病毒。

3 結論與討論

本研究建立了利用SYBR Green I染料法檢測ScYLV的實時熒光RT-PCR體系。該體系相關性好 （r2=0.993），特異性強，線性范圍寬、靈敏度高、重復性好且具有操作簡便、快速等優點。檢測結果真實可靠，可以定量檢測田間受ScYLV不同致病力（強、弱和中等）感染的株系，其Ct值的高低直接反應了各株系中ScYLV含量的高低。同時靈敏度比常規RT-PCR高出100倍，這不僅減少了假陽性和假陰性問題的出現，更適于對那些亞感病或無癥狀感染植株的診斷。大大提高了該病毒的檢出率，克服了常規PCR因靈敏度不夠而導致樣品檢測出現假陰性的不足。

因此，本研究建立的實時熒光RT-PCR體系非常適合于檢測ScYLV這樣在寄主中含量較低的病毒，并且具有成本相對低廉、檢測速度快、無需PCR后處理等諸多優點。J.Korimbocus等[11]應用Taqman-MGB探針法檢測ScYLV，本文所建立方法與此相比，具有檢測成本低，檢測方便等特點，檢測時只需要在反應體系中加入模板，檢測的特異性只取決于引物的特異性，適宜大規?？焖贆z測。該方法的建立為ScYLV的檢測、防治以及無病毒苗木的生產提供了強有力的技術支持，也可以應用于ScYLV的YLS效果評價和深入研究中。

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