基于細菌酯酶活性的疊氮噻唑橙分子設計與特性驗證*

余以剛 黃韻 李曉鳳 肖性龍 吳暉

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

食源性致病菌檢驗的關鍵是食品中“活”的致病菌的存在性檢測和準確定量［1］．目前用于區別活菌和死菌的標準主要有:是否可培養、是否有代謝活性以及細胞膜是否完整．分離培養法對于活的非可培養狀態的細菌會出現漏檢［2］．EMA/PMA-qPCR活菌檢測技術利用新型核酸染料EMA(疊氮溴化乙錠)或PMA(疊氮溴化丙錠)滲入膜損傷的細胞后，與DNA發生共價結合，從而抑制膜損傷細胞DNA在PCR反應中的擴增［3］．該方法實際上是通過細胞膜的完整性來對“死”、“活”細胞進行區分檢測［4］．有研究表明，這種活菌PCR技術在方法和原理上仍存在不足［5-8］．細胞膜損傷可能是細菌死亡的一種極端表現形式，以細胞膜的完整性作為區分死、活菌的檢測標準存在缺陷．因此，建立一套基于生物代謝活性的活菌分析方法，使其既可有效檢測出活菌(包括VBNC菌)，又可克服EMA/PMA-qPCR方法在原理上的不足，對于膜完整或膜損傷的死細胞不檢測，這也符合致病菌檢測的根本要求．

為了通過細胞內有無代謝活性來區分活、死菌，達到更精確的致病菌活菌檢測的目的，筆者設計了一種對細菌生物代謝活性敏感的新型噻唑橙熒光染料(簡稱TOMA)，它主要由3個功能基團構成:一是噻唑橙基團(使分子可以自由穿透細胞)，二是疊氮基團(在光照下與核酸共價結合后抑制核酸擴增)，三是連接兩個基團并含有一個酯鍵的柔性碳鏈(酯鍵對生物酯酶活性敏感，可被酯酶水解斷裂)．TOMA選取了具有細胞穿透性的菁染料作為DNA結合基團，故可進入所有細胞．利用帶酯鍵的碳鏈，可將染料基團與疊氮基團連接起來，而在酯酶水解作用下，兩個基團可相互分離．在活性細胞內，TOMA分子中的碳鏈被酶解斷裂，疊氮基團從分子上脫落;反之，在無活性的細胞內，疊氮基團不會脫落，在可見光的作用下與 DNA共價交聯形成共價化合物，抑制DNA后續擴增．而游離的TOMA分子，其疊氮基團因在可見光作用下與水反應生成羥胺而被鈍化．因此，結合TOMA與定量PCR(qPCR)技術建立新型活菌檢測技術來區分活、死菌，將依賴于細胞體內的酯酶活性，而不是細胞膜完整性，理論上可比以往的活菌檢測技術更準確．為建立以“細菌酯酶代謝活性”作為判斷細菌存活標準的活菌檢測技術，文中通過人工設計合成了TOMA分子，并嘗試在實驗室條件下對TOMA分子的預期功能特性進行了體外驗證．

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 實驗菌株與培養條件

實驗所用菌株為金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)(ATCC6538)、大腸桿菌(Escherichia coli)O157:H7(ATCC6589)以及單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)(CMCC34761)，均為實驗室保存菌種．

細菌培養采用LB液體培養基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10 g/L)，pH 值調至 7．0，培養基經過121℃、20min滅菌后使用．將細菌分別接種到30 mL LB液體培養基中，于37℃下180 r/min搖床中過夜培養16 h(OD600≈1)．液體培養基中添加1．5%(質量分數)的瓊脂粉即得相應的固體培養基，用于平板法測可培養菌數．

1．1．2 試劑及儀器

所用試劑均為分析純或色譜純;固定化脂肪酶Novozym435(固定化于大孔丙烯酸樹脂，酶活力10U/mg)購自丹麥 NovoNordisk Industries公司;細菌基因組DNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司;PCR AmpLification Kit購自TaKaRa公司．

Waters 1525-ZQ2000型液相質譜聯用儀、高效液相色譜儀、2996 PDA型檢測器，美國沃特世公司生產;Bruker Biospin AG AV 600型核磁共振儀，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司生產;Laica SP5型激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡微系統有限公司生產;鹵鎢燈，650W，購自德國Osram公司;臺式高速冷凍離心機，德國艾本德股份有限公司生產;水浴鍋購自新加坡雷蒙特實驗設備公司;ABI7500型熒光定量PCR儀，購自美國應用生物系統公司．

1．2 TOMA染料的合成

TOMA分子的合成路線如圖1所示，委托上海輝睿生物技術有限公司合成．目標物經合成與純化后，使用高分辨質譜儀與核磁共振儀對分子結構進行確證，粉末于4℃下避光保存．1H NMR(600MHz，d6-DMSO):δ1．33 ～1．42(m，2H，CH2)，1．54 ～ 1．63(m，2H，CH2)，1．84 ～ 1．89(m，2H，CH2)，2．28 ～2．36(t，2H，CH2)，3．38 ～3．43(t，2H，CH2)，4．14 ～4．18(t，2H，CH2)，4．57 ～4．63(t，2H，CH2)，6．92 ～6．96(s，1H，═CH)，7．34～7．38(d，1H，Ar-H)，7．40～7．44(t，1H，Ar-H)，7．57 ～7．63(t，1H，Ar-H)，7．72 ～7．76(t，1H，Ar-H)，7．77 ～7．80(d，1H，Ar-H)，7．95 ～8．01(t，1H，Ar-H)，8．04 ～8．08(d，1H，Ar-H)，8．11 ～8．14(d，1H，Ar-H)，8．62 ～8．66(d，1H，Ar-H)，7．87 ～8．83(d，1H，Ar-H)．

圖1 目標化合物TOMA的合成路線Fig．1 Synthetic route of target compound TOMA

1．3 TOMA分子功能驗證

1．3．1 TOMA對細菌胞膜的穿透性驗證

稱取50mg TOMA粉末溶解于1 mL 20%(體積分數)的二甲基亞砜(DMSO)中，得到50 mg/mL的儲備液．向90μL無菌超純水中加入10μL TOMA儲備液，混勻，得到5mg/mL的TOMA工作液．

分別取500μL新鮮培養的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7以及單增李斯特菌菌液于1．5 mL離心管中，6000 r/min離心3 min，等體積無菌水重懸．菌液中加入TOMA工作液1μL使菌液中TOMA終濃度為10 μg/mL，充分混勻后，于室溫下暗處孵育10min．將離心管水平放置于冰上，于650W的鹵鎢燈下方20cm處進行5min光照，期間輕輕搖晃冰盒保證溶液得到充分照射．陰性對照組使用無菌超純水代替TOMA溶液．

對經TOMA處理后的菌體使用10%(體積分數)福爾馬林緩沖液進行固定．吸取5 μL固定完畢的菌液，滴在無自發熒光的載玻片中央，加入甘油封片劑，蓋上蓋玻片后使用透明指甲油封閉．制成樣本后用激光共聚焦顯微鏡觀察結果(激發波長488nm，發射波長520nm，100倍油鏡)．

1．3．2 TOMA對脂肪酶的敏感性驗證

酶處理條件:將0．238 g/L TOMA溶液5 mL(2．5μmoL)，于 40℃水浴中預熱 2min，脂肪酶用量0．5 ～3．5U，充分混勻后，于40℃、150 r/min 黑暗下處理20 min．濾膜過濾，濾液用于高效液相色譜(HPLC)分析檢測水解后產物(避光)．HPLC條件:色譜柱采用 Zorbax SB-C18柱(4．6 mm×250 mm，5μm);流動相為水∶乙腈 =60∶40(體積比)的磷酸鹽緩沖液(0．02 mol/L，pH 值 6．99 ～ 7．01);柱溫30℃;流量1mL/min;進樣量10 μL;采用 PDA檢測器，激發波長488nm，發射波長520nm．對照組中，使用等濃度未經酶解的TOMA溶液代替酶解液．結果以降解率表示，計算公式如下:

降解率=(酶解前TOMA含量-酶解后TOMA含量)/對照組TOMA含量×100%．其中，TOMA的含量以mg/mL為單位計．

1．3．3 TOMA對DNA擴增的抑制作用驗證

分別取 500 μL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌菌液于1．5 mL離心管中，6000r/min離心3 min，收集菌體，等體積無菌水重懸．按照細菌基因組DNA快速提取試劑盒操作說明提取基因組DNA．分別向提取的3種細菌DNA中加入 TOMA 溶液使終濃度達到 0．0、0．5、1．0、3．0、5．0、10．0、15．0、20．0 mg/L，充分混勻后于黑暗處靜置5min，然后側放于碎冰上，在鹵鎢燈下方約20cm處光照5min，使TOMA與DNA交聯，同時鈍化溶液中游離的TOMA分子．將經過光照處理的DNA溶液作為實時熒光定量PCR反應模板，考察TOMA對DNA擴增的抑制作用．用DNAStar Seqman模塊(美國DNASTAR公司)對上述3種細菌分別進行基因序列比對、用Primer Express 2．0(美國應用生物系統公司)設計引物和探針．引物和探針序列如表1所示．

表1 引物和探針序列Table 1 Nucleotide sequences of primers and fluorogenic probes

熒光定量PCR反應體系總體積為25 μL，其中含10 ×Buffer 2．5μL、25mmol/L 的Mg2+溶液3．5μL、25mmol/L 的 dNTPs 1 μL、15 μmol/L 的前后引物各1μL、10 μmol/L 的探針 1 μL、模板溶液 2 μL、Taq DNA 聚合酶2．5U、DEPC 水12．5μL．反應條件:95℃預變性2min，95℃變性5s，然后降溫至60℃并保持40s(收集熒光信號)，該過程進行40個循環．反應結束后40℃保溫2min．每個熒光定量PCR反應各進行3次平行實驗，計算平均Ct值(熒光信號達到設定的閾值所經歷的循環數)和樣本標準差SD值．

2 結果與討論

2．1 TOMA分子表征與預期特性

PMA對DNA擴增的抑制作用源于分子上連接的疊氮基團，其在光作用下于原位與DNA發生共價結合，使DNA在PCR反應中無法進行復制，有效性早已得到廣泛承認［9-12］．PMA分子完全不具細胞膜穿透性，但對一些具有可逆性的部分膜損傷細胞(如存在于環境樣本中的細菌)以及部分膜完整的活菌，染料仍會穿透細胞膜，造成假陰性檢測結果［13-15］．此外，對經過紫外照射、冷凍滅菌等方法滅菌后仍保持細胞膜完整性的死菌，采用基于PMA的活菌PCR方法來評估會造成活細胞數目的嚴重高估，容易對檢測結果產生誤導［16］．文中設計合成的TOMA是在總結PMA作用原理的基礎上，利用噻唑橙類菁染料具有細胞膜通透性的特點，將PMA的功能與噻唑橙染料的優點進行聯合應用．噻唑橙類染料能夠自由滲透細胞膜，本身無自發熒光，與核酸結合后熒光顯著增強．目前對這類染料的應用主要集中在核酸熒光標記定位方面．Carreon等［17］合成了4種結構不一的菁染料，對細胞線粒體進行了成像與定位．與已知的噻唑橙染料的結構相比，TOMA在喹啉環的一側通過帶有單個酯鍵的柔性碳鏈連接了疊氮基團，其相對分子質量為474．6，吸收光譜在488nm，發射光譜在520nm，分子結構經高分辨質譜儀及核磁共振儀表征無誤．在分子設計上，TOMA分子柔性碳鏈上的酯鍵更靠近疊氮基團(而非噻唑橙基團)，目的是使成功被水解脫落的疊氮基團分子更小，更有利于減小疊氮基團脫落后與DNA發生交聯的概率．

TOMA的預期特性有3個:一是能自由穿透細胞膜;二是分子中的羧酸酯鍵能被生物體內大量存在的酯酶水解;三是未經酯酶水解的TOMA分子與DNA結合并發生交聯后，能抑制DNA在PCR反應中的擴增．

2．2 TOMA對細菌的透膜效果

用Laica SP5激光共聚焦顯微鏡(100倍油鏡，放大1000倍)觀察TOMA穿透細胞膜與細菌DNA結合的效果．結果顯示TOMA對3種細菌均具有良好的細胞膜穿透性，菌體經TOMA處理后發出強烈熒光．使用TOMA對活的大腸桿菌O157:H7處理后的顯微圖像及未經TOMA處理的大腸桿菌O157:H7的顯微圖像如圖2所示．

從圖2可見，菌懸液經過TOMA處理后，TOMA透過細胞膜進入菌體，與DNA發生特異性結合，所有菌體均產生了強烈綠色熒光，說明連接在TOMA分子上的疊氮基團并沒有影響分子與DNA的結合以及熒光增強，TOMA與DNA結合后產生的熒光強度也沒有因為疊氮基團的存在而出現明顯下降．未經TOMA處理的菌體未檢測出任何熒光．

噻唑橙類染料表現出與DNA的高結合率及結合后熒光強度的顯著增長，使其很適合作為DNA探針［18］．TOMA利用了噻唑橙染料可在細胞中自由擴散、通過被動運輸透過細胞膜的特性，因此對活細胞和死細胞的DNA和RNA都可以進行結合染色(發出熒光)，對革蘭氏陽性和陰性細菌的核酸亦均可結合染色．TOMA自身沒有熒光，是由于次甲基橋鏈兩端的苯并噻唑(頭部)和喹啉環(尾部)之間的自由旋轉造成的，當有核酸參與時，頭部與核酸的小溝結合，尾部插入堿基中，迫使頭部和尾部發色團位置固定，導致熒光強度大大增強［19］．因此，通過顯微鏡觀察到，使用TOMA處理后細菌的菌體發出熒光，這可作為判斷TOMA成功結合菌體DNA的標準．實驗結果表明，TOMA分子具有自由穿透細菌壁膜的特性，能夠成功穿透所有菌體細胞進入菌體內與DNA結合．TOMA對細胞膜的高穿透性，是利用TOMA建立起一套比PMA-qPCR檢測方法更準確的活菌檢測技術的前提．

圖2 經過TOMA處理和未經TOMA處理的大腸桿菌O157:H7的熒光顯微圖像Fig．2 Fluorescence images of Escherichia coli O157:H7 with and without TOMA treatment

2．3 TOMA的酶活敏感性

TOMA采用帶有對酶活敏感的羧酸酯鍵的柔性碳鏈作為噻唑橙基團與疊氮基團的連接臂，是因為酯酶在細胞內普遍大量存在而且種類繁多．脂肪酶屬于酯酶下的一個亞類，基本上存在于所有的生物體中［20］，對維持生物體正常的功能運轉有重要作用．目前已有成熟的基于活細胞酯酶活性的熒光染色試劑盒上市．如PromoKine公司的Live/Dead Cell Staining試劑盒，采用中性非熒光底物CTOMAein-AM對細胞進行處理，CTOMAein-AM滲透入活性細胞內后，分子的內酯鍵(羧酸酯鍵)被非特異性酯酶切斷，生成不能穿過細胞膜的綠色極性熒光物質而被阻留在細胞體內［21］．

在5mL 0．238g/L TOMA溶液中添加不同量的固定化脂肪酶，40℃、150r/min下處理20min后，使用HPLC上機檢測．TOMA降解率隨脂肪酶用量(以每μmol TOMA中添加的脂肪酶的量計)的變化情況如圖3所示．

由圖3可見，酶用量在0．2 ～1．0 U之間時，TOMA的降解率隨酶用量增加呈上升趨勢，降解率與酶用量之間成簡單線性關系;繼續增加酶用量至1．2、1．4 U，降解率基本不發生變化，說明過量的脂肪酶并不能提高TOMA的降解效果;而酶量不足會直接影響TOMA的降解效率，這一點與TOMA分子設計的初衷相符合．因為當細菌喪失生物代謝能力時，TOMA在菌體內將無法被降解，在后續的光照中疊氮基團在原位與DNA進行交聯，從而抑制DNA在PCR反應中擴增．反之，在具有代謝活性的細胞中，TOMA中連接噻唑橙基團和疊氮基團的羧酸酯鍵被水解，疊氮基團從分子上脫落，失去后續與DNA交聯的能力，對DNA擴增無影響．對于VBNC菌，菌體的酶活性可能較低，適當延長細菌與TOMA的孵育時間有助于反應完全．此外，從圖3可以看出，本實驗使用的脂肪酶最佳酶用量應為1．0U，此時TOMA的降解率達到83%以上．

體外實驗結果表明，TOMA分子中的酯鍵設計達到了預期目的．實驗中TOMA分子上連接的酯鍵對酯酶活性表現敏感，可在短時間內被脂肪酶水解，使疊氮基團脫落．而酯酶在活細胞內大量存在，因此，利用TOMA判斷細胞是否具有生物代謝活性是可行的．設計TOMA分子，是希望通過細胞生物代謝活性的有無，選擇性地抑制無代謝活性的細菌的DNA擴增，從而達到對活菌進行定量檢測的目的．

然而，不同屬不同株的細菌體內表達的酶類與酶量之間有差異，不同存活狀態下細菌代謝活力也不盡相同．因此，對食源性致病菌體內酯酶種類、活性進行鑒定和測定后，探索幾種典型食源性致病菌在不同存活狀態下酯酶代謝活性水平的差異特征，從而進一步優化TOMA的使用方法，是下一步研究的方向．

2．4 TOMA對DNA擴增的抑制效果

TOMA分子中的疊氮基團與EMA/PMA中的疊氮基團相同．當分子在水溶液狀態下被光照時，疊氮基團迅速失去自由氮產生活性氮烯，與水形成羥胺衍生物，當分子處于與DNA結合狀態而非游離狀態時，由于氮烯對DNA的進攻，分子的疊氮基團與DNA形成共價鍵，從而在原位生成共價復合物［22］．與疊氮基團共價結合后的DNA無法參與PCR擴增．

TOMA濃度對DNA擴增的影響如圖4所示．由圖4可見，3種細菌的DNA在PCR反應中的Ct值均隨著TOMA濃度的增大而顯著增大，表明TOMA與DNA結合后，分子上的疊氮基團對DNA擴增的抑制效果明顯，并且抑制效果與TOMA濃度呈正相關．使用低濃度(0．5、1．0 mg/L)TOMA 處理的 DNA溶液，其PCR反應后的Ct值與TOMA濃度為0的DNA溶液的相比增幅不大，說明使用過低濃度的TOMA對DNA擴增的影響不大，因此，采用低濃度的TOMA在活菌檢測中可能會造成假陽性的結果．實驗中TOMA濃度為10．0 mg/L時，TOMA對DNA的抑制作用明顯，此時Ct值達到36左右，繼續增大TOMA濃度至15．0 mg/L對Ct值僅有輕微影響．而當TOMA濃度達到20．0mg/L時，整個PCR反應過程無檢出，推測可能過高濃度的TOMA會對PCR反應有抑制作用．實驗表明，TOMA分子中連接的疊氮基團在光照下能成功對DNA進行共價交聯作用，在合適的濃度條件下能充分抑制DNA在PCR反應中的擴增．

圖4 TOMA濃度對DNA擴增的影響Fig．4 Effect of TOMA concentration on DNA amplification

3 結語

文中設計合成了一種新型噻唑橙衍生物TOMA，并分別從3個方面對TOMA的預期特性進行驗證．結果表明:連接疊氮基團的TOMA分子可以自由透過細菌的細胞膜;TOMA分子上的酯鍵能在酶作用下被快速高效降解;TOMA分子對DNA擴增具有明顯的抑制作用．TOMA分子的預期功能特性在體外實驗中得到了初步證實，為進一步運用TOMA對細菌進行活菌檢測研究提供了重要參考．后續研究中，擬將TOMA與實時熒光PCR技術結合起來，利用死/活細菌體內生物活性的差異來對致病菌進行快速有效的檢測．由于TOMA對細菌體內的生物活性敏感度高，TOMA應用在致病菌活菌檢測技術中能同時克服傳統qPCR法假陰性和PMA-qPCR法假陽性的缺點，有效識別VBNC菌、非膜損傷死菌等，為致病菌活菌檢測手段提供新的方向．

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