藏藥大三果抗氧化活性研究

項朋志,余 洪,劉 瓊,胡顯智

(1.昆明理工大學國土資源工程學院,云南昆明650093;2.云南開放大學化學工程學院,云南昆明650222; 3.昆明理工大學理學院,云南昆明650093)

藏藥大三果抗氧化活性研究

項朋志1,2,余 洪1,劉 瓊2,胡顯智3

(1.昆明理工大學國土資源工程學院,云南昆明650093;2.云南開放大學化學工程學院,云南昆明650222; 3.昆明理工大學理學院,云南昆明650093)

研究了藏藥大三果藥劑三果湯含片及配伍三種成分毛訶子、訶子、余甘子清除超氧陰離子自由基(·)、羥基自由基(·OH)的能力。結果表明,三者清除·能力大小依次為:毛訶子＞余甘子＞訶子,清除·OH能力大小依次為:毛訶子＞訶子＞余甘子。此外,分析毛訶子、訶子、余甘子及三果湯含片中活性成分沒食子酸的含量發現,三果湯含片的抗氧化性能主要與三種配伍成分中沒食子酸的含量有一定關系。

大三果;抗氧化;超氧陰離子自由基;羥基自由基

大三果由訶子(Fructus chebulae)、毛訶子(Fructus terminaliae billericae)和余甘子(Phyllanthus emblica L.)組成,因為三種果實常配伍聯用,或以它們為主藥配伍為三果散、三果湯等劑型,所以簡稱大三果[1,2]。大三果在我國高原藏區有悠久的使用歷史和豐富的文獻記載?！端牟酷t典》記載其“主治瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型”。在三果湯散處方配伍配比及用藥劑量上,印度傳統醫藥將訶子、毛訶子和余甘子三種藥材的比例確定為1∶1∶1,而藏醫藥會根據臨床不同情況而調整比例。

研究發現,自由基除參與三大疾病(心血管疾病、腫瘤、神經興奮及損傷)的發病過程外,與應激、缺氧等生理急劇反應也密切相關,超氧陰離子自由基(·)、羥基自由基(·OH)是生物體內主要的活性氧自由基,它們引發的體內脂質過氧化是機體衰老、動脈硬化、心血管病及腫瘤發生的重要原因,而使用生物抗氧化劑切斷過氧化鏈式反應,可以抑制機體的自由基損傷,從而保持健康狀態和防治相關疾病,延緩衰老[3]。目前針對藏藥大三果抗氧化能力研究較少。為此,作者研究了大三果主配方三種成分毛訶子、訶子、余甘子對·、·OH的清除能力,擬為大三果藥物使用提供借鑒。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

三果湯含片(Z20030060),成都三勒漿藥業集團四川華美制藥有限公司;沒食子酸對照品、訶子對照藥材、毛訶子對照藥材、余甘子對照藥材,中國藥品生物制品檢定所。

三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、鄰苯三酚、水楊酸、蘆丁(美國Sigma公司)、過氧化氫、硫酸鐵、無水乙醇,均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。

UV1800型紫外可見分光光度計,日本島津; PHS-3C型酸度計,金壇科興;BSA-124D型電子天平,德國賽多利斯科學儀器有限公司;KQ3200E型超聲波清洗儀,昆山超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液及對照品溶液的配制

取三果湯含片研細,稱取0.1 g置于具塞錐形瓶中,精密稱定,精密加入乙醇20 m L,搖勻,稱定質量,超聲處理15 min,冷卻至室溫后,稱定質量,用乙醇補足減失的質量,搖勻,過濾,精密吸取續濾液1 mL置于10 m L容量瓶中,加入15%乙醇稀釋定容,搖勻,即得供試品溶液;分別稱取5 g訶子對照藥材、毛訶子對照藥材、余甘子對照藥材,加入20 m L乙醇,超聲35 min,過濾后轉入到50 m L容量瓶,定容,即得供試品溶液。

精密稱取沒食子酸對照品4.5 mg置于10 m L容量瓶中,加甲醇適量,超聲處理10 min使完全溶解,冷卻至室溫后加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得0.45 mg· m L-1的沒食子酸對照品溶液。

精密稱取蘆丁對照品5.0 mg置于50 m L容量瓶中,加甲醇適量,超聲處理10 min使完全溶解,冷卻至室溫后加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得0.1 mg·m L-1的蘆丁對照品溶液。

精密稱取20 mg抗壞血酸,用約1 g·L-1的草酸溶解后定容至100 m L,搖勻,即得0.2 mg·m L-1的抗壞血酸對照品溶液。

在50 m L 0.1 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷中加入12.5 m L 0.1 mol·L-1鹽酸溶液,稀釋至100 m L,得到p H值為9.0的緩沖溶液,分別加入不同濃度的訶子、毛訶子、余甘子供試品溶液,再加入1 m L 0.2 mmol·L-1鄰苯三酚溶液和2 m L蒸餾水,于340 nm處測吸光度。以0.2 mg·m L-1抗壞血酸溶液作為對照?！で宄?D)按下式計算:

式中:A空為不加樣液時溶液的吸光度;A樣為加樣液時溶液的吸光度。

1.2.3 ·OH清除活性的測定

采用Fenton法[5,6]。H2O2和Fe2+混合發生Fenton反應生成具有很高反應活性的·OH,·OH與水楊酸反應生成有色物質,抗氧化物質加入后,會與水楊酸競爭,有色產物的生成量減少。通過測定吸光度的變化即可分析抗氧化物質對·OH的清除作用。

向試管中加入2 m L不同濃度的訶子、毛訶子、余甘子供試品溶液,依次加2 m L 6.5 mmol·L-1FeSO4溶液、2 m L 2.5 mmol·L-1H2O2溶液,搖勻,靜置10 min,再加入2 m L 7 mmol·L-1水楊酸溶液,搖勻,然后35℃水浴25 min,于2500 r·min-1離心12 min,取上清液于500 nm處測吸光度。以0.1 mg·m L-1蘆丁溶液為對照?！H清除率(D′)按下式計算:

式中:A'空為不加樣液時溶液的吸光度;A'樣為加樣液時溶液的吸光度。

1.2.4 沒食子酸含量測定

沒食子酸含量測定采用酒石酸亞鐵法[7]。

2 結果與討論

圖1 余甘子(a)、訶子(b)、毛訶子(c)對超氧陰離子自由基的清除率Fig.1 Superoxide anion free radical scavenging rate of Phyllanthus emblica L.(a),Fructus chebulae(b) and Fructus terminaliae billericae(c)

從圖1可以看出,在0.05～0.25 mg·m L-1濃度范圍內,余甘子的·清除率隨著濃度的增大逐漸上升,在0.10～0.25 mg·m L-1范圍內,清除率與濃度呈一定的線性關系,當濃度為0.25 mg·m L-1時·清除率最大,達到了54.3%,這與文獻[1]結果基本一致;訶子和毛訶子的·清除率也隨其濃度的增大逐漸上升。進一步計算得到余甘子、訶子、毛訶子及三果湯含片的IC50分別為0.15 mg·m L-1、1.80 mg ·m L-1、0.135 mg·m L-1、1.68 mg·m L-1?？傮w來看,余甘子、訶子和毛訶子對·的清除能力較好,能力大小依次為:毛訶子＞余甘子＞訶子,其中毛訶子效果最好、訶子效果較差,三果湯含片清除·能力介于訶子和余甘子之間。余甘子、訶子、毛訶子及三果湯含片與0.2 mg·m L-1的抗壞血酸相比較,·清除率均低于抗壞血酸。

2.2 三果湯含片及配伍成分對·OH的清除能力

測定了余甘子、訶子、毛訶子對·OH的清除率,結果見圖2。

圖2 余甘子(a)、訶子(b)、毛訶子(c)對羥基自由基的消除率Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging rate of Phyllanthus emblica L.(a),Fructus chebulae(b)and Fructus terminaliae billericae(c)

從圖2可以看出,隨著余甘子濃度的增大,·OH清除率逐漸上升,余甘子濃度為0.8 mg·m L-1時,清除率最大,為81.7%,略低于相同測定條件下蘆丁的·OH清除率91.2%,但與文獻[7]中余甘子多糖的·OH清除率相當;訶子的·OH清除率最大達到82. 6%,與相同條件下蘆丁的·OH清除率87.8%相差不大;毛訶子的最大·OH清除率略低于相同測定條件下蘆丁的·OH清除率。進一步計算得到余甘子、訶子、毛訶子和三果湯含片的IC50分別為0.43 mg ·m L-1、0.40 mg·m L-1、0.35 mg·m L-1、0.32 mg·m L-1?？傮w來看,余甘子、訶子和毛訶子的·OH清除能力較·O-2清除能力更好,能力大小依次為:毛訶子＞訶子＞余甘子,其中毛訶子顯示出較強的抗氧化性,這可能和毛訶子中所含的沒食子酸含量較高有關。三果湯含片的·OH清除能力要好于余甘子、訶子和毛訶子。

2.3 三果湯含片及配伍成分活性成分分析

根據2005版《中國藥典》,余甘子中主要含沒食子酸等成分,訶子和毛訶子中主要含沒食子酸、蘆丁等成分[8],三種配伍成分中均含有沒食子酸。在藏藥大三果的化學指紋圖譜研究中,根據保留時間初步定性了沒食子酸等4個成分,其中沒食子酸為三果湯散主要化學成分[9]。推測大三果藥劑三果湯含片的抗氧化性能可能與其中沒食子酸含量有關。4種樣品中沒食子酸的含量及其清除·、·OH-能力見表1。

表1 4種樣品中沒食子酸含量及其清除·、·OH能力Tab.1 The gallic acid content of the four samples and their abilities to scavenge·,·OH

表1 4種樣品中沒食子酸含量及其清除·、·OH能力Tab.1 The gallic acid content of the four samples and their abilities to scavenge·,·OH

樣品 沒食子酸含量/% IC50/mg·m L-1·O-2· 3.26 0.15 0.43訶子 3.76 1.80 0.40毛訶子 4.83 0.135 0.35三果湯含片OH余甘子3.26 1.68 0.32

從表1可以看出,單味藥余甘子、訶子、毛訶子均具有一定的抗氧化作用,且毛訶子抗氧化作用最強,三果湯含片抗氧化能力居中,這說明就抗氧化能力而言,三果湯含片并沒有表現出較強的協同作用。從表1還可以看出,沒食子酸含量較高時,表現出較強的抗氧化能力,即三果湯含片及配伍成分的抗氧化能力與其中的沒食子酸含量有一定關聯。值得注意的是,僅以沒食子酸含量來說明抗氧化性存在一定的局限性,大三果其它成分也可能參與了抗氧化作用,有必要采用多指標從整體上對三果湯含片進行評價。

3 結論

研究了藏藥大三果藥劑三果湯含片及配伍三種成分毛訶子、訶子、余甘子清除·、·OH的能力。結果表明,三者清除·能力大小依次為:毛訶子＞余甘子＞訶子,清除·OH能力大小依次為:毛訶子＞訶子＞余甘子。此外,分析毛訶子、訶子、余甘子及三果湯含片中活性成分沒食子酸的含量發現,三果湯含片的抗氧化性能主要與三種配伍成分中沒食子酸的含量有一定關系。

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Study on Antioxidant Activity of Tibetan Medicine Da San Guo

XIANG Peng-zhi1,2,YU Hong1,LIU Qiong2,HU Xian-zhi3
(1.Faculty of Land Resource Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650093,China;2.College of Chemical Engineering,Yunnan Open University,Kunming 650222,China;3.College of Science,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650093,China)

The scavenging capacity for·and·OH were studied of Tibetan medicine Da San Guo(San Guo soup tablets)and of its three compatibility components Fructus terminaliae billericae,Fructus chebulae, Phyllanthus emblica L..The results showed that the the scavenging capacity followed the order of Fructus terminaliae billericae＞Phyllanthusemblica L.＞Fructus chebulae as·was concerned and the the scavenging capacity followed the order of Fructus terminaliae billericae＞Fructus chebulae＞Phyllanthus emblica L.as far as·OH was concerned.The gallic acid content of Da San Guo soup tablets and its three components were also determined,and the results suggested that the antioxidant activity of Da San Guo soup tablets might be related to the the gallic acid content of its three kinds of compatibility.

Da San Guo;antioxidant;superoxide anion free radical;hydroxyl free radical

O 652

A

1672-5425(2013)11-0027-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.11.007

云南省教育廳科學研究基金資助項目(2011C163)

2013-08-20

項朋志(1978-),男,湖北黃岡人,講師,研究方向:電化學分析,E-mail:794059143@qq.com。