小鼠硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基轉移酶Hs2st的生理功能和體外應用

謝觀蓮,李學亮,鐘衛鴻

(浙江工業大學生物與環境工程學院,浙江杭州310032)

小鼠硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基轉移酶Hs2st的生理功能和體外應用

謝觀蓮,李學亮,鐘衛鴻

(浙江工業大學生物與環境工程學院,浙江杭州310032)

硫酸乙酰肝素(HS)是由多個硫酸化結構的二糖單位重復形成的線型多糖,并以共價鍵形式與核心蛋白質連接形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,而硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基轉移酶(Hs2st)為硫酸乙酰肝素多糖鏈硫酸化修飾的主要硫酸基轉移酶,它將硫酸基團轉移至L-艾杜糖殘基的C2位。研究表明,HS的2-O-硫酸化對于HS與眾多生長因子或受體進行相互作用是很重要的。缺乏功能性酶Hs2st的胚胎只能存活至出生前,臨產時會由于無法形成完整的腎臟而死亡。這種致命性暗示了HS的2-O-硫酸化在小鼠胚胎發育過程中有著重要的作用。從形態學和分子水平上對Hs2st在小鼠胚胎發育過程中的重要性及其在肝素/HS合成過程中的作用進行了綜述。

硫酸乙酰肝素;硫酸乙酰肝素-2-O-硫酸基轉移酶(Hs2st);小鼠;肝素/HS合成

硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate preteoglycans,HSPG)是基底膜(Basement membrane,BM)中普遍存在的重要成分。HSPG能夠結合BM的層粘連蛋白、Fibulin和Ⅳ性膠原等多種成分,BM以外的細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)如纖維連接蛋白等多種成分也能與HSPG結合。HSPG與細胞外多功能信號分子的結合是通過變化多樣的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)鏈來進行的[1]。

基底膜糖蛋白與成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)等細胞因子及其細胞膜受體結合時修飾和調節多種細胞內信號的功能分子,不僅參與胚胎器官發生、血管再生和組織重建,而且在癌細胞增殖、轉移和浸潤過程中起著重要的作用。研究表明,這些作用不僅與HS的多糖鏈有關,而且與其多糖鏈的修飾程度有關。參與HS多糖鏈修飾的酶主要有N-脫乙酰/N-硫酸化轉移酶(NDST)、C5-異構酶和O-硫酸轉移酶。在這些酶中,硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基轉移酶(Hs2st)將硫酸基團轉移至L-艾杜糖殘基的C2位。艾杜糖殘基的C2位是HS的常見成分,在許多天然的HS多糖鏈上均發現了不同量的已硫酸化的艾杜糖殘基[2-4]。

目前醫藥級別的肝素均由動物組織中提取得到,雖然利用動物組織提取肝素方法簡單、易操作,但是由于肝素的需求量不斷增加,僅僅通過動物組織提取獲得肝素已經無法滿足需求,此外,2008年的過硫酸軟骨素污染事件,也讓人們質疑從動物體提取肝素的安全性。因此,安全生產肝素和硫酸乙酰肝素已成為迫切需要解決的問題。

1 Hs2st的酶學和分子生物學特性

1.1 Hs2st的克隆表達

一般RT-PCR擴增后,在胚胎及成年小鼠的多種組織中均可檢測到Hs2st m RNA表達,且表達水平較高。Wlad等[4]從小鼠肥大細胞組織中純化得到一種60 k Da的酶,可以同時催化2-O和6-O硫酸基轉移。Kobayashi等[5]和Habuchi等[6]從CHO培養細胞中分別提取純化得到44 k Da Hs2st和52 k Da Hs6st,與Wlad等獲得的O-硫酸基轉移酶有區別,說明肝素和HS之間的O-硫酸化和N-硫酸化過程的分子組織是不一樣的。為了明確這些不同之處,Kobayashi等[7]從CHO cDNA文庫中通過探針篩選獲得編碼Hs2st的基因序列,其cDNA包含一個1068 bp的可讀框,編碼一條由356個氨基酸殘基組成的多肽鏈。

Hs2st cDNA(NCBI序列號D88811)的氨基端包含4個ATG密碼子。將第一個ATG所在的序列與真核表達翻譯后的序列[8]對比,發現-3位的堿基是不保守的,而+4位的堿基G則是保守的。Thornberry等[9]研究表明,在缺失-3位堿基的情況下,+4位的堿基G對于高效翻譯十分重要。其它3個ATG所在的序列(Met7、Met8、Met24)也與翻譯序列部分一致。這些ATG的-3位置分別是A、A、G,而+4位置不是G,分別是A、C、C。然而第4個ATG密碼子(Met24)在氨基端的跨膜區,因此不可能成為起始位點。根據氨基酸序列可知,從CHO細胞中克隆獲得的Hs2st屬于Ⅱ型跨膜蛋白。在氨基末端,有一段疏水端緊接在一段很短的細胞溶質親水端之后,這段親水端作為未裂解的信號錨定序列。在疏水端之后是一段可能朝著高爾基體內腔的親水端。這些特征與其它的高爾基蛋白類似,如肝素/HS N-脫乙?；?N-磺基轉移酶[10-12]。

Kobayashi等[7]將全長cDNA與真核表達載體連接后在COS-7細胞中表達,Hs2st的活性與對照組相比提高了2.6倍,且融合蛋白FLAG-Hs2st經過純化后只呈現出Hs2st的活性。Liu等[13]通過p MAL-c2X與Hs2st全長cDNA(Arg51～Asn356)連接,導入大腸桿菌進行原核表達,得到的融合蛋白MBPHs2st純化后在SDS-PAGE上檢測得到75 k Da的條帶,且純化率高于80%。融合蛋白MBP-Hs2st即使不切除MBP標簽也能表現出Hs2st的活性且高度可溶。

1.2 Hs2st的活性及底物特異性

Liu等[13]在用酶合成法修飾HS的過程中,先將O-硫酸基轉移酶固定化,能使其活性更加穩定。檢測O-硫酸基轉移酶的活性需要3′-硫酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)作為硫酸化轉移酶的供體。PAPS再生體系最初是由Burkart等[14]研究得到的,應用于肝素和硫酸乙酰肝素的酶學合成。當硫酸基團轉移到受體上時,PAPS轉變為3′-磷酸腺苷-5′-磷酸(PAP)。然而, PAP會抑制HS硫酸轉移酶的活性,同時在毫克級別合成HS過程中很難將其去除。PAPS再生體系中,芳香磺基轉移酶(AST-Ⅳ)催化硫代對硝基苯酚(PNPS)轉變為對硝基苯酚(PNP)釋放硫酸基團,同時催化PNP轉變為PAPS。因此,HS硫酸基轉移酶利用PNPS作為硫酸基供體,而不是PAPS(圖1)[14,15]。Liu等[13]以CDSNS heparin作為底物、[35S] PAPS作為硫酸基供體,通過比較結合的35S的量來檢測Hs2st的修飾程度。

圖1 PAPS再生體系Fig.1 PAPS Regeneration system

Chen等[16]研究了從小鼠肥大細胞組織中獲得的Hs2st的底物特異性。他們將不一樣的多糖作為硫酸受體底物檢測Hs2st的修飾程度,結果表明,以O位脫硫酸化的肝素(由[(4)αIdo A(1)-(4)αGlc NSO3(1)-]n組成)作為底物時,經過Hs2st修飾獲得2-O-硫酸化的艾杜糖醛酸;而以從E.coli K5中獲得的N位硫酸化的莢膜多糖[(4)βGlc A(1)-(4)αGlc NSO3(1)-]n作為底物時,硫酸基僅被轉移至葡萄糖醛酸的C2位;此外,如果底物同時含有艾杜糖酸和葡萄糖醛酸殘基,那么硫酸基更趨于轉移至艾杜糖酸殘基的C2位。

2 Hs2st在小鼠胚胎發育過程中的作用

通過基因誘捕策略已證實在編碼Hs2st基因中存在隱性致死插入突變[3,17]。此策略是通過將載體插入到該基因的開放閱讀框中的內含子進行的。其中,載體的拼接受體5′端于框內融合至lac Z報告基因中。此外,該載體不僅在內源基因的表達上起作用,而且會截斷內源轉錄,因此是可誘變的。這種突變會導致Hs2st的失活,進而生成完全缺少2-O-硫酸基團的HS[18]。

研究者從Hs2st-/-胚胎成纖維細胞中純化獲得未進行2-O-硫酸化的HS,暗示了HS生物合成酶之間的調控影響。奇怪的是,這種不規則的HS雖然能與一定的生長因子結合,但卻抑制了野生型HSPGs作為共同受體的功能。盡管如此,Hs2st-/-小鼠的表型明確地說明了HS的2-O-硫酸化在多數器官的發育中的重要性。

2.1 Hs2st對腎臟發育的影響

在Hs2st-/-新生小鼠的泌尿生殖器部位,腎臟缺失,僅有盲管狀的尿管存在,但副腎、膀胱和卵巢等其它器官基本正常[19]。后腎是通過2個中胚層誘導體——上皮尿管芽(UB)與后腎間質(MM)相互作用而形成的。HS可以在腎臟中找到,但卻是以一種最高濃度形式存在于UB和MM間的基底膜中[20,21]。輸尿管芽反復延伸、分支,最終形成集合管。在純合型變異小鼠胚胎中幾乎未發現尿管芽分支,也未見明確的間充質凝集,提示腎臟發生停止而不是延遲[22]?？梢哉J定,尿管周圍的間充質聚合和尿管分支結構形成過程中必須有Hs2st基因。尿管芽上皮不表達Hs2st基因,僅于后腎間充質高表達,由此能充分說明純合子胚胎腎臟形態發生的異常。

2.2 Hs2st對中樞神經系統形成的影響

中樞神經系統的形成和修飾是通過神經管上分泌的信號分子作用而進行的。神經管是一種柱狀上皮,最初是單個的厚層。在發育早期,神經系統就呈向脊髓及背脊髓兩種模式。隨后,內表層的神經管發育成神經前體,通過細胞周期形成不一樣的分化神經元,并遷移至神經外表層,使得神經管不斷加厚并確定了分化神經元多個分層的最終組成。在Hs2st-/-突變體中,盡管Hs2st在底板區(Floor plate region)和頂板區(Roof plate region)大量表達[3],背脊髓的神經模式仍然不受影響,向脊髓模式也正常發生。在大腦皮層和脊髓的加厚過程中,雖然Hs2st突變體的量有輕微減少現象,但Hs2st突變體卻是可再生的。與此同時,那些表達Hs2st的組織中的神經前體擴散量也呈減少趨勢。

2.3 Hs2st對骨骼發育的影響

在大多數骨骼中,軟骨模型形成最早,于妊娠中后期就開始形成。在每根骨頭的特定形成時間內,存在于各自特有成分中央的軟骨細胞會退出細胞周期,且變大,最后被成骨細胞退化,進而形成礦化骨。骨骼中的軟骨內部是通過相同的軟骨不斷增殖而形成的。軟骨存在于長骨的任意一端。雙向信號調節一系列發生在軟骨及其周邊的組織(軟骨膜)的活動,這些活動導致細胞從增殖庫中移除,并且使得細胞過分增大,最后被礦化骨替換[23,24]。軟骨膜和生長板間的互惠信號能夠維持母細胞的增殖和軟骨的特異化間的平衡,以確保骨骼能繼續生長。組成大多數頭蓋骨的骨頭都有著不一樣的形成過程,稱作膜內成骨,在此過程中,神經嵴衍生細胞直接特異化為成骨細胞且不需要軟骨雛形便能產生礦化骨。從Hs2st-/-小鼠中可具體觀察到骨骼石灰化增加、胸骨異位骨化、頸部脊椎骨融合。Hs2st基因在骨骼形成期間的軟骨膜上高度表達,表明這些表達模式與骨骼的異常發生密切相關[25]。

2.4 Hs2st對小鼠其它組織器官形成的影響

其它一些較小但卻是可再生的缺陷也是很明顯的。視網膜色素上皮細胞分化造成的虹膜雙向缺損現象多見于新生同質接合體[21]。在突變體中,不正常的視網膜色素上皮細胞于交配后12.5 d時就已經很明顯,Hs2st同質接合體中生殖系統的發育在雄性體中是完全正常的,然而在雌性性分化途徑中卻出現畸形的現象。雌性體內臟中的大腸稍微短一點,繼發腭裂也很常見,其在突變體中發生的概率約為50%,這是因為骨化被擾亂,或者是因為2-O硫酸化的HS在前后軸的延伸中起到的輔助作用[21]。

3 Hs2st在肝素/HS合成過程中的作用

肝素和HS有共同的合成途徑,研究HS的生物合成機制為改變HS在細胞中的合成提供了基礎。不同于蛋白質和核酸,多糖的合成是沒有模板的,是在表達水平上控制其特定的蛋白序列。HS的生物合成在高爾基體中進行,然而其核心蛋白質的生物合成是在內質網(ER)上進行的?？傊?HS的生物合成是一個復雜的過程,包括骨架的延伸和修飾。

3.1 酶學方法合成肝素/HS的研究

酶學方法合成HS是基于HS在生物體內合成的代謝途徑,利用來自微生物合成的Heparosan,在各種體外重組的HS生物合成酶的催化作用下合成HS。利用生物合成酶合成的HS具有抗凝血活性。已有報道利用生物合成酶合成HS,其中含有AT結合位點,雖然產量僅達到微克級別,但得率為1.1%,明顯高于化學合成的0.5%,說明此方法是可行的。Lindahl等[22]利用來自大腸桿菌的莢膜多糖Heparosan,采用化學方法和酶法合成抗凝血肝素的類似物,已經得到AT結合戊糖、抗凝血劑HS、抗凝血CDSNS肝素、3-O-辛糖。

3.2 Hs2st對Heparosan進行硫酸化修飾

通過酶學方法對Heparosan進行多糖硫酸化修飾,從而得到多糖類似物,硫酸化轉移酶進行硫酸化修飾時需要硫酸基供體PAPS。參與Heparosan硫酸化衍生物合成的酶主要有N-脫乙酰/N-硫酸化轉移酶(NDST)、2-O-硫酸轉移酶、6-O-硫酸轉移酶、3-O-硫酸轉移酶等。

首先對Heparosan進行N位的脫乙酰及N位的硫酸化,通過核磁檢測結構圖比對N位的處理情況,接著,C5-異構酶對Heparosan骨架進行異構化,不同的硫酸基轉移酶對相應的O位進行硫酸化修飾。Heparosan骨架在N-脫乙酰/N-硫酸基轉移酶的催化作用下脫乙?；鶊F生成N-硫代葡萄糖胺(Glc NS),同時將磺酸基轉移至N-葡萄糖胺。N-硫酸化骨架生成后,C5-異構酶將葡萄糖醛酸(Glc UA)單位異構化為艾杜糖醛酸(Ido UA),其后多糖側鏈分別經過2-O-硫酸基轉移酶、6-O-硫酸基轉移酶、3-O-硫酸基轉移酶硫酸化修飾得到HS[14-16],其中Hs2st將硫酸基團轉移至L-艾杜糖殘基的C2位。

4 結語

深入研究Hs2st的生物學功能和體外應用可以為探討Hs2st在多種生物中的作用機制奠定基礎。此外,通過研究小鼠體內Hs2st引起突變或是其它的HS生物合成酶引起突變的現象能很好地解釋HS在胚胎發生過程中的功能模型,且易于進行生物化學、細胞生物學及胚胎學的分析。

從動物組織中提取肝素存在安全隱患,且采用傳統化學方法合成肝素效益低,因此酶學方法制備肝素受到了人們的廣泛關注。硫酸化多糖近年來已用于預防和臨床治療某些疾病,而它們的治療作用主要與增加其分子量及硫酸化程度相關,Hs2st的研究將為有關疾病的治療提供新的靶點。

[1] Hiroko H,Koji K.Heparan sulfate proteoglycans mediating the epithelial and mesenchymal interaction[J].Seikagaku,2001,73 (10):1246-1256.

[2] Perrimon N,Bernfield M.Specificities of heparan sulphate proteoglycans in developmental processes[J].Nature,2000,404(6779): 725-728.

[3] Merry C L,Bullock S L,Swan D C,et al.The molecular phenotype of heparan sulfate in the Hs2st-/-mutant mouse[J].Journal of Biological Chemistry,2001,276(38):35429-35434.

[4] Wlad H,Maccarana M,Eriksson I,et al.Biosynthesis of heparin——Different molecular-forms of O-sulfotransferases[J]. Journal of Biological Chemistry,1994,269(40):24538-24541.

[5] Kobayashi M,Habuchi H,Habuchi O,et al.Purification and characterization of heparan sulfate 2-sulfotransferase from cultured Chinese hamster ovary cells[J].Journal of Biological Chemistry, 1996,271(13):7645-7653.

[6] Habuchi H,Habuchi O,Kimata K,et al.Purification and characterization of heparan sulfate 6-sulfotransferase from the culture medium of Chinese hamster ovary cells[J].Journal of Biological Chemistry,1995,270(8):4172-4179.

[7] Kobayashi M,Habuchi H,Habuchi O,et al.Molecular cloning and expression of Chinese hamster ovary cell heparan-sulfate 2-sulfotransferase[J].Journal of Biological Chemistry,1997,272(21): 13980-13985.

[8] Acland P,Dixon M,Peters G,et al.Subcellular fate of the lnt-2 oncoprotein is determined by choice of initiation codon[J].Nature,1990,343(6259):662-665.

[9] Thornberry N A,Bull H G,Calaycay J R,et al.A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes[J].Nature,1992,356(6372):768-774.

[10] Hashimoto Y,Orellana A,Gil G,et al.Molecular cloning and expression of rat liver N-heparan sulfate sulfotransferase[J].Journal of Biological Chemistry,1992,267(22):15744-15750.

[11] Orellana A,Hirschberg C B,Wei Z,et al.Molecular cloning and expression of a glycosaminoglycan N-acetylglucosaminyl N-deacetylase/N-sulfotransferase from a heparin-producing cell line [J].Journal of Biological Chemistry,1994,269(3):2270-2276.

[12] Humphries D E,Lanciotti J,Karilinsky J B,et al.cDNA Cloning,genomic organization and chromosomal localization of human heparan glucosaminyl N-deacetylase/N-sulphotransferase-2[J].Biochemical Journal,1998,332(2):303-307.

[13] Liu J,Linhardt R,Avci F,et al.Enzymatic synthesis of sulfated polysaccharides[P].WO 2006/124 801.

[14] Burkart M D,Izumi M,Chapman E,et al.Regeneration of PAPS for the enzymatic synthesis of sulfated oligosaccharides[J].The Journal of Organic Chemistry,2000,65(18):5565-5574.

[15] 王暢,嚴子琴,趙雷,等.基于修飾Heparosan合成肝素的研究進展[J].生物技術進展,2012,2(3):177-183.

[16] Chen J,Avci F Y,McDowell L M,et al.Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate[J].Journal of Biological Chemistry,2005,280(52):42817-42825.

[17] Bullock S L,Fletcher J M,Beddington R S P,et al.Renal agenesis in mice homozygous for a gene trap mutation in the gene encoding heparan sulfate 2-sulfotransferase[J].Genes&Development,1998,12(12):1894-1906.

[18] Kobayashi T,Habuchi H,Tamura K,et al.Essential role of heparan sulfate 2-O-sulfotransferase in chick limb bud patterning and development[J].Journal of Biological Chemistry,2007,282 (27):19589-19597.

[19] Dressler G R,Deutsch U,Chowdhury K,et al.Pax2,a new mu-rine paired-box-containing gene and its expression in the developing excretory system[J].Development,1990,109(4):787-795.

[20] Pachnis V,Mankoo B,Costantini F,et al.Expression of the c-ret proto-oncogene during mouse embryogenesis[J].Development, 1993,119(4):1005-1017.

[21] Davies J,Lyon M,Gallagher J,et al.Sulphated proteoglycan is required for collecting duct growth and branching but not nephron formation during kidney development[J].Development, 1995,121(5):1507-1517.

[22] Lindahl U,Li J P,Kusche-Gullbery M,et al.Generation of"neoheparin"from E.coli K5 capsular polysaccharide[J].Journal of Medicinal Chemistry,2005,48(2):349-352.

[23] Wallis G A.Bone growth:Coordinating chondrocyte differentiation[J].Current Biology,1996,6(12):1577-1580.

[24] Merry C L,Wilson V A.Role of heparan sulfate-2-sulfotransferase in the mouse[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,2002,1573(3):319-327.

[25] Cadwalader E L,Condic M L,Yost H J,et al.2-O-Sulfotransferase regulates Wnt signaling,cell adhesion and cell cycle during zebrafish epiboly[J].Development,2012,139(7):1296-1305.

Physiological Function and in vitro Application of Mouse Heparan Sulfate 2-O-Sulfotransferase

XIE Guan-lian,LI Xue-liang,ZHONG Wei-hong
(College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032,China)

Heparan sulfate is a linear polysaccharide found in all animal tissues.2-O-sulfation within HS, particularly of iduronate residues,is essential for HS to participate in a variety of high-affinity ligand-binding interactions and signaling processes.Heparan sulfate 2-O-sulfotransferase(Hs2st)catalyzes the transfer of sulfate to the C2-position of selected hexuronic acid residues within the maturing HS.Previous studies have concluded that 2-O-sulfation of HSis essential for it to cooperate in many growth factor/receptor interactions.Surprisingly therefore,embryos lacking functional Hs2st survive until birth,but die perinatally,suffering complete failure to form kidneys.However,this rather late lethality belies a more intricate involvement of 2-O-sulfated HS during development.The purpose of this review is to summarize the requirements for Hs2st during mouse development at the morphological and molecular level,and its role in the synthesis of heparin and HS.

heparan sulfate;heparan sulfate 2-O-sulfotransferase(Hs2st);mouse;synthesis of heparin and HS

Q 781

A

1672-5425(2013)07-0001-05

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.001

國家自然科學基金資助項目(21076195),教育部博士點基金資助項目(2011331711004),浙江省科技廳國際合作項目(2011C24007)

2013-04-08

謝觀蓮(1987-),女,福建龍巖人,碩士研究生,研究方向:酶學與基因工程,E-mail:xieguanlian@163.com;通訊作者:鐘衛鴻,教授,博士生導師,E-mail:whzhong@zjut.edu.cn。