類人膠原蛋白-銅螯合物的制備及相關性質研究

俞園園

(1.西北大學化工學院陜西省可降解生物醫用材料重點實驗室,陜西西安710069; 2.陜西學前師范學院化學與化工系,陜西西安710100)

類人膠原蛋白-銅螯合物的制備及相關性質研究

俞園園1,2

(1.西北大學化工學院陜西省可降解生物醫用材料重點實驗室,陜西西安710069; 2.陜西學前師范學院化學與化工系,陜西西安710100)

采用水體系合成法,以類人膠原蛋白為有機配體制備了類人膠原蛋白-銅螯合物,重點考察了反應體系的p H值和質量配位比對銅螯合率的影響,并利用紫外可見吸收光譜和傅立葉紅外光譜對銅螯合物進行分析檢測。確定優化的合成條件為:體系p H值11.0,類人膠原蛋白與硫酸銅的質量比10∶1。分析結果表明:類人膠原蛋白和無機Cu2+之間存在相互作用,生成的銅螯合物是一種不同于類人膠原蛋白的新化合物;羰基(C=O)和亞氨基(N-H)均與蛋白質-金屬螯合物的形成有關,且該螯合物保持了類人膠原蛋白分子本身的α-螺旋結構。為類人膠原蛋白-銅螯合物的進一步研究開發奠定了基礎。

類人膠原蛋白;銅;螯合

蛋白質在機體的生長和發育過程中承擔著基礎性的生物學功能,銅是蛋白質氧化還原反應中重要的催化輔因子。銅也是生物體內必需的一種微量元素[1],機體保持銅元素內穩態十分重要[2]。另外,銅還與哺乳動物體內有效的鐵吸收和轉運密切相關[3]。

傳統的補銅制劑為無機鹽,但其生物利用率通常較低,近年來,人們對補銅制劑進行了大量研究,特別是銅的氨基酸、短肽以及低分子量蛋白質螯合物,其中銅螯合物不僅生物利用率較高[4]、對機體無毒副作用,同時還具有一些重要的藥理學效應,包括抗炎、抗菌、抗潰瘍、抗驚厥甚至抗腫瘤活性[5]。

類人膠原蛋白(Human-like collagen,HLC)是一種利用基因工程技術生產的重組蛋白質,與傳統的動物源膠原蛋白相比具有無病毒隱患、化學結構明確、生物相容性良好、免疫原性低、可加工性高等優點[6,7]。在科研人員對氨基酸/多肽-銅螯合物進行研究的基礎之上[8,9],作者采用水體系合成法,以類人膠原蛋白為有機配體制備銅螯合物,考察了體系p H值和質量配位比對銅螯合率的影響,并通過紫外可見吸收光譜和傅立葉紅外光譜對類人膠原蛋白-銅(HLC-Cu)螯合物進行分析檢測,為HLC-Cu螯合物的進一步研究奠定了基礎。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

類人膠原蛋白,西安巨子生物基因技術有限公司;其余試劑均為國產分析純。

So LAARM6型原子吸收分光光度計,Thermo Scientific;2802pcs型紫外可見分光光度計,Unico;EQUINOX-55型傅立葉紅外光譜儀,Bruker;FE 20型精密p H計,Mettler Toledo;1200型磁力攪拌器,Jenway;FD5-8型真空冷凍干燥機,Sim。

1.2 方法

稱取一定量HLC溶于蒸餾水中,室溫下攪拌20 min使其完全溶解,再向其中加入一定量的CuSO4溶液,用1.0 mol·L-1的NaOH溶液調節p H值至一定值,反應30 min,將反應混合液置于透析袋中,每隔4 h換水一次,過夜透析,以除去其中未參與反應的游離Cu2+。將透析后的溶液真空冷凍干燥36 h,得到HLC-Cu螯合物,置于密封袋中保藏。

1.3 分析檢測

(1)采用硫化鈉法對HLC-Cu螯合物進行定性檢測[10]。

(2)準確移取HLC-CuSO4混合溶液10 m L于100 m L容量瓶中,定容,搖勻,用原子吸收分光光度計測定銅元素總量。另取透析后的HLC-Cu螯合物溶液10 m L,同法測定螯合態銅元素的含量。HLC對Cu2+的螯合率(簡稱螯合率)按下式計算:

(3)用雙蒸水將制備的HLC-Cu螯合物配制成濃度為1 mg·m L-1的樣品溶液。室溫下測定樣品溶液的紫外可見吸收光譜。

(4)稱取HLC-Cu螯合物凍干品2 mg,與100 mg固體KBr混合研磨,壓片。室溫干燥條件下測定樣品的FTIR光譜。

2 結果與討論

2.1 類人膠原蛋白-銅螯合物合成工藝的優化

本實驗采用水體系合成法[11,12]制備HLC-Cu螯合物。研究認為,水體系中生成金屬螯合物的反應本質是SN2取代反應,即游離配體分子的進攻螯合與配位水分子的離去是該反應過程中的速率決定步驟,一般情況下金屬離子在水體系中的配位反應是一個室溫下的快速反應過程,時間和溫度對其影響較小。因此,本研究重點考察反應體系的p H值和質量配位比(即配體分子與CuSO4的質量之比,RHLC/Cu)對HLC-Cu螯合物制備的影響。

2.1.1 p H值的選擇

設定p H值分別為10.0、10.5、11.0、11.5、12.0,探討其對形成HLC-Cu螯合物的影響,結果見圖1。

圖1 p H值和質量配位比對螯合率的影響Fig.1 The effects of p H value and chelating mass ratio on chelating rate of Cu2+by HLC

由圖1可知,p H值過高或過低均不利于金屬螯合物的生成,當p H值為11.0時,螯合率最高。這是因為,p H值較低時,反應體系呈酸性,此時體系中存在的H+將會與Cu2+競爭配體(供電子基團);p H值較高時,反應體系呈堿性,此時體系中存在的OH-將與配體爭奪Cu2+(電子受體),導致生成Cu(OH)2。因此,確定適宜的反應體系p H值為11.0。

2.1.2 質量配位比的選擇

質量配位比過小,形成的螯合結構不穩定,導致生成的螯合物穩定性較差;質量配位比過大,則造成HLC不必要的浪費。設定質量配位比RHLC/Cu分別為10∶1、10∶2、10∶3、10∶4和10∶5,探討其對形成HLC-Cu螯合物的影響,結果見圖1。

由圖1可知,隨著質量配位比的減小即Cu2+濃度的增大,螯合率相應提高。由于銅是一種重金屬元素, Cu2+濃度過大會使蛋白質發生沉淀變性,導致其生物活性喪失。鑒于此,對不同質量配位比下制備的HLC-Cu螯合物凍干品進行復水實驗,結果見表1。

表1 類人膠原蛋白-銅螯合物的復水實驗結果Tab.1 The result of redissolution of HLC-Cu complexes

由表1可知,只有當RHLC/Cu為10∶1時,螯合物凍干品才能復溶于水。因此,確定適宜的質量配位比為10∶1。

2.2 定性檢測(表2)

表2 類人膠原蛋白-銅螯合物的定性檢測結果Tab.2 The qualitation result of HLC-Cu complex

由表2可知,最終溶液變為藍紫色,說明其中存在游離的HLC。這些游離的蛋白質分子是在Na+置換出Cu2+后才出現的,即最終溶液中的HLC分子原來是與Cu2+相結合的。由此證明制備得到的產物為HLC-Cu螯合物,既不同于以離子狀態在水中存在的鹽,也與不溶于水的銅鹽沉淀不同,其穩定性介于銅鹽沉淀和可溶性銅鹽之間。

2.3 紫外可見吸收光譜分析(圖2)

由圖2可知,HLC的特征吸收峰在220 nm附近,這是由蛋白質分子中肽鍵上羰基(C=O)的n→π*躍遷引起的。酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是蛋白質分子中敏感的生色團,分別在283 nm和251 nm處有吸收,其主要來源于Tyr酚基和Phe苯基對光的吸收[13]。HLC在283 nm和251 nm附近均無吸收,與動物膠原蛋白在220～230 nm處有吸收、而在280 nm附近幾乎沒有吸收的結論一致。

圖2 類人膠原蛋白及其銅螯合物的紫外可見吸收光譜Fig.2 The UV-visible absorption spectra of HLC and HLC-Cu complex

由圖2還可知,與純HLC相比,HLC-Cu螯合物的紫外可見吸收光譜的最大吸收峰的位置發生紅移,且強度增加。表明,HLC分子和Cu2+之間存在相互作用,且生成的銅螯合物是一種不同于HLC的新化合物。

2.4 傅立葉紅外光譜分析(圖3)

圖3 類人膠原蛋白及其銅螯合物的傅立葉紅外光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectra of HLC and HLC-Cu complex

對圖3進行分析:

(1)酰胺Ⅰ帶主要來源于羰基的伸縮振動(νC=O),同時伴隨N-H的面內彎曲振動、CN的伸縮振動以及CCN的變形振動[14,15]。研究表明,酰胺Ⅰ帶與二級結構類型之間具有下列指認關系:β-轉角,1660～1700 cm-1;α-螺旋,1645～1659 cm-1;無規卷曲,1640～1644 cm-1;β-折疊,1620～1640 cm-1[16]。Cu2+與HLC間的相互作用使HLC分子中酰胺Ⅰ帶的位置由1651.41 cm-1移至1658.07 cm-1,表明羰基參與了該螯合物的形成過程,且Cu2+并未對HLC配體的二級結構產生影響,所形成的螯合物仍保持HLC配體相同的α-螺旋結構。

(2)酰胺Ⅱ帶主要代表N-H鍵的彎曲振動[15,17]。與Cu2+作用后,HLC分子中酰胺Ⅱ帶的位置由1549.14 cm-1偏移至1560.96 cm-1,表明HLC中的N-H基團與Cu2+發生了螯合配位作用。

(3)酰胺Ⅲ帶是C-N基團伸縮振動和酰胺鍵中N-H基團變形振動的聯合峰,同時包括來自甘氨酸骨架和脯氨酸側鏈的CH2基團的非平面振動[18]。HLC-Cu螯合物的酰胺Ⅲ帶分別出現在1240.76 cm-1和1243.58 cm-1處。有研究表明,IR比例(指酰胺Ⅲ帶所處位置與1455.63 cm-1處的比例)約等于1意味著螺旋結構的存在[19]。HLC及其銅螯合物的IR比例分別為0.852和0.854,表明Cu2+與HLC發生相互作用時,Cu2+對HLC分子的螺旋結構未產生顯著影響,這與酰胺Ⅰ帶處的結論一致。

(4)酰胺A帶主要來自于自由N-H基團的伸縮振動(νN-H)[20,21]。νN-H的位置受氫鍵和與Cu2+發生配位的N原子的影響。配位作用發生后,亞氨基的N-H伸縮振動頻率較配位前低,同時峰強增大。HLC及其銅螯合物中的酰胺A帶分別出現在3419.84 cm-1和3395.15 cm-1處,證明N-H基團與螯合物的形成有關,這與酰胺Ⅱ帶處的結論一致。

(5)酰胺B帶對應于CH2的非對稱伸縮振動[22,23]。HLC及其銅螯合物的酰胺B帶分別位于2931.43 cm-1和2932.61 cm-1處,二者位置極其接近,表明CH2基團未參與HLC與Cu2+的螯合過程。

綜上所述,與純HLC分子的FTIR光譜相比, HLC-Cu螯合物在功能基團的吸收峰位置和強度方面均有所不同,羰基(C=O)和亞氨基(N-H)均與該螯合物的形成有關,而且所得到的螯合物依然保持了HLC分子本身的α-螺旋結構。

3 結論

(1)采用HLC為有機配體制備HLC-Cu螯合物,優化的合成條件為:體系p H值11.0、HLC與CuSO4的質量比10∶1,在此條件下HLC對Cu2+的螯合率達90%。

(2)分析表明,待測樣品以HLC-Cu螯合物的形式存在;HLC和Cu2+之間存在相互作用,生成的HLC-Cu螯合物是一種不同于純蛋白質的新化合物;羰基(C=O)和亞氨基(N-H)均參與HLC-Cu螯合物的形成過程,且引進Cu2+并未破壞HLC分子本身的α-螺旋結構。

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Study on Preparation and Properties of the Complex of Human-Like Collagen with Copper

YU Yuan-yuan1,2
(1.Shaanxi Key Laboratory of Degradable Biomedical Materials,School of Chemical Engineering, Northwest University,Xi'an 710069,China;2.Department of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi Xueqian Normal University,Xi'an 710100,China)

In this paper,the complex of human-like collagen(HLC)with copper is prepared in aqueous solution and is analyzed by UV-vis absorption spectroscopy and FTIR.The effects of p H value and chelating mass ratio on the coordination efficiency are investigated,and the optimum synthetic conditions are as follows:the p H value of 11.0 and the mass ratio of HLC to copper sulfate of 10∶1.Moreover,it can be concluded from UV-vis absorption spectra that there exists interaction between HLC and copper ions,and the complex is a new chemical compound different from pure protein.In the complex of copper,HLC acts as ligand,linking the copper ions via both groups of C=O and N-H,and the complex retains theα-helical structure of HLC.The results provide theoretical evidence for the further study of the complex of HLC with copper.

human-like collagen(HLC);copper;coordination

Q 816

A

1672-5425(2013)07-0029-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.008

陜西省教育廳自然科學專項項目(2013JK0703),陜西學前師范學院科研基金項目(2013KJ082)

2013-05-03

俞園園(1983-),女,浙江紹興人,博士后,講師,研究方向:蛋白質化學,E-mail:yuyuanyuan0317@163.com。