11個德國甜菜品種指紋圖譜的構建

吳則東 ，王華忠 ，馬龍彪 ，王茂芊

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150080；2.中國農業科學院甜菜研究所/黑龍江大學農作物研究院，哈爾濱 150080；3.中國農業科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱 150080）

甜菜是我國北方重要的經濟作物，建國后，我國的甜菜育種事業開始起步，從引進國外的品系到育成自己的甜菜品種。而甜菜的種植面積也由建國時的1.59萬公頃增加到1998年的41.5萬公頃[1]，此后，我國甜菜種植面積開始萎縮，目前甜菜種植面積基本維持在22萬公頃[2]。從2000年開始，國外的甜菜品種開始進入我國，并陸續占領中國甜菜種子市場，目前國外甜菜品種已經占到中國甜菜種子市場的95%以上，其中德國KWS公司是外國公司在我國甜菜種子方面開展活動時間最長、范圍最廣、推出品種及育種材料最多、種子繁殖及銷售量最大的公司[3]。而德國斯特儒博公司的甜菜品種近幾年來在我國的種植面積也在逐年增大。

目前我國對甜菜品種的鑒別依然采用形態學的方法，此種方法不僅鑒定周期長，而且準確率差。由于SSR標記具有簡單、共顯性、條帶清晰、重復性好等特點已經廣泛地應用到作物品種指紋圖譜的構建[4]。目前甜菜SSR引物已經有上千對[5]，完全能夠滿足品種指紋圖譜的構建。筆者選擇生產上大面積推廣種植的德國品種KWS0143、KWS2409、KWS5145[6]，以及近幾年剛剛審定命名的德國品種，利用SSR分子標記進行指紋圖譜的構建，以期為品種鑒定以及維護育種公司以及農民的利益提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗用的11份德國進口的甜菜品種分別來自于德國的KWS公司和斯特儒博公司，所有的品種均由國內甜菜研究機構提供。品種名稱及來源見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將11份甜菜種子播種于黑龍江大學呼蘭校區溫室營養缽中，待長到4片真葉時，每個品種取10株，經真空冷凍干燥機處理后，將葉片打磨成干粉，利用堿裂解法[7]快速提取甜菜基因組DNA，經λDNA 檢測后，最后稀釋到 10ng/μL。

1.2.2 引物 我們從黑龍江大學農作物研究院重點實驗室篩選出來的核心引物中選擇了5對多態性相對較高、帶型清晰、易分辨且重復性好的引物，它們是 SB09[8]、S6、S7[9]、SB04[8]和 S2[9]（表 2），引物由上海生工合成，HAP 純化，每對引物均按照說明稀釋到10μM的工作液。

1.2.3 SSR體系及 PCR程序 反應體系為 10μL，其中包括 10×PCR buffer 1μL， 模板 DNA 1μL，0.5μL dNTPs（2.5mM each），10μM的正反向引物各0.4μL，Taq DNA聚合酶0.5U，最后加滅菌去離子水至總體積10μL。 PCR 程序：95℃預變性 1min，然后 94℃變性 40s，54℃退火 40s，最后 72℃延伸 40s，35個循環；反應結束后，再72℃延伸5min，4℃保存。擴增反應在PTC-100上進行。擴增產物于8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，然后采用快速銀染法[10]顯色并照相記錄。

表1 品種來源及其編號

表2 SSR核心引物及其序列

1.2.4 數據處理 每個電泳的泳帶按照分子量從大到小進行記錄，在相同的位置上，有帶記為1，無帶記為0，利用0和1數字構建11個品種的指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 SSR引物的擴增

SSR擴增銀染結果見圖1，從圖中我們可以看出，每對引物均擴增出了清晰的條帶，每條引物擴增出的條帶最多是8條，最少是2條，這5對引物共擴增出34個條帶，其中31個為多態性條帶，多態性條帶占到總條帶的91.17%。

圖1 8%聚丙烯酰胺凝膠銀染圖

2.2 SSR指紋圖譜的構建

雖然我們選擇的4對SSR引物均具有很高的多態性，但是由于甜菜的遺傳基礎比較狹窄，所以任何單一的一對引物都不能夠將所有的11個甜菜品種區分開來，從銀染圖可以清晰地看出，單獨的SB04可以區分開2、3和9號品種，S6能夠區分開4、10和11號品種，S7能夠區分開1、3和7號品種，S2能夠區分開1、5和8號品種，而SB09中沒有特異性的條帶，不能單獨用于品種的區分。除了6號品種外，其余10個品種的鑒別只需要利用能夠區分此品種的引物進行擴增，然后再和標準指紋圖譜進行比對，就可確認品種的真偽及其純度。而利用S6和S7兩對引物就可以很好地把6號品種區分開。

3 結論與討論

傳統的品種純度鑒定的方法大都采用形態學鑒定法，形態學鑒定法不僅周期長，而且鑒定的效果差，容易受到環境條件的影響。而以分子標記為基礎的品種純度和真實性的鑒定技術不受環境條件的影響，鑒定時間短，準確度高。而目前的分子標記技術中，RAPD重復性較差，AFLP不僅有專利條件的限制，而且操作復雜，一般的實驗室難以掌握，而SRAP條帶較多，統計困難[11]；SSR分子標記因其條帶較少、統計方便、重復性好而在種子純度和真實性鑒定中備受青睞。目前國家品種鑒定的行業標準都是以SSR分子標記為基礎的，如GB/T1433-2007《三系雜交水稻及親本真實性和品種純度鑒定DNA分析方法》、NY/T1433-2007《水稻品種鑒定DNA指紋方法》、NY/T1432-2007《玉米品種鑒定DNA指紋方法》、DB51/T808-2008《雜交玉米品種真實性和純度SSR分子檢測技術方法》等等[12]。本文利用特殊引物法及指紋技術首次構建了11個德國引進品種的指紋圖譜，為解決將來可能出現的品種糾紛打下了堅實的技術基礎。

致謝：非常感謝內蒙古自治區農牧業科學院甜菜研究所、新疆農業科學院經濟作物研究所、新疆石河子農科中心甜菜研究所在甜菜品種提供上給予的幫助。

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