甜菜磷酸蔗糖合成酶的轉基因研究

劉大麗 ，馬龍彪 ，郝 慧

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.中國農業科學院北方糖料作物資源與利用重點實驗室/中國農業科學院甜菜研究所，哈爾濱 150080）

甜菜是我國主要的糖料作物之一，其含糖率及產量直接關系到糖料的生產和發展[1]。常規的育種方法在提高產量和含糖率上逐漸表現出來了很大的局限性。隨著生物技術和分子生物學的發展，基因工程技術為解決這一難題提供了有效而便捷的方法。

蔗糖是植物體內光合同化物由葉到果實的主要運輸形式，也是決定甜菜品質形成的關鍵因子[2－3]。高等植物的蔗糖代謝是一個復雜的過程，其中，蔗糖磷酸合成酶（Suerosephosphate synthase，EC2.3.1.14，SPS）與蔗糖的代謝密切相關。SPS是一種可溶性酶，存在于細胞質中，催化如下可逆反應：UDPG+6-磷酸果糖?6-磷酸蔗糖+UDP。許多果實成熟過程中蔗糖積累與SPS活性的升高密切相關[4－5]。因此，克隆甜菜BvSPS基因，并進而將其轉化到甜菜植株中去，能夠有效地提高甜菜塊根的含糖率及品質，進而有效地促進我國甜菜產業的發展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

實驗所用的甜菜試管苗、植物表達載體pBI121、農桿菌菌株EHA105由黑龍江大學甜菜遺傳育種重點實驗室提供。T4 ligase （Biolabs）；Trans5α 感受態細胞（Transgen）；Taq DNA polymerase（Transgen）；限制性內切酶（MBI）；未特殊注明試劑均為進口分析純。

1.2 pBI121-BvSPS植物表達載體的構建

分別將順式插入甜菜 BvSPS（Genbank accession no.X81975）基因的 pMD 18-T-BvSPS載體[6]、pBI121載體用PstI、SacI限制性內切酶酶切，Tris飽和酚提純后用Klenow大片段補平，再經過Tris飽和酚提純后用XbaI限制性內切酶酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳回收BvSPS片段及pBI121片段；將目的片段BvSPS和載體pBI121按照3∶1的摩爾比建立連接反應體系，16°C連接過夜；連接產物轉化到Trans5α感受態細胞中，通過Kana抗性篩選出待測陽性克??；待測克隆經過質粒提取及PCR鑒定，引物參見[6]，進一步確定重組子pBI121-BvSPS。重組質粒轉化到農桿菌EHA105中，待用。

1.3 農桿菌介導的甜菜遺傳轉化

以甜菜無菌苗的葉柄為轉基因的外植體，將其置于預培養培養基（MS+0.5 mg/L 6-BA）中2 d；分別用濃度為OD600=0.4、0.6、0.8的含有pBI121-BvSPS的農桿菌侵染甜菜葉柄外植體，侵染時間為5 min、10 min、15 min，然后置于共培養培養基（MS+0.5 mg/L 6-BA+100 μmol/L AS）中暗培養 2 d、4 d、6 d；最后，轉入篩選培養基（MS+0.5 mg/L 6-BA+200 mg/L Kana）中進行抗性芽的分化和篩選。

1.4 甜菜基因組DNA的提取及轉基因甜菜的分子鑒定

利用CTAB法提取甜菜基因組DNA。根據甜菜BvSPS基因及pBI121的序列信息，利用Primer premier 5.0設計鑒定引物：上游引物（5'-3'）為 GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT；下游引物（5'-3'）為 CCT GAC GTG GAT TGG AGT TAT，擴增片段長度約為680 bp，引物由上海生工合成。

取 100 ng 甜菜基因組 DNA 為模板進行 PCR 擴增，反應條件為：94°C，4 min；94°C（30s）；62°C（45s）；72°C（1 min），39個循環；72°C延伸10min。擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并利用GenSnap 6.08（f）進行檢測。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體pBI121-BvSPS的構建

實驗分別利用pBI121、pMD 18-T-BvSPS進行酶切以獲得連接所需的載體及目的片段。如圖1所示，通過質粒提取及特異引物的PCR鑒定，pBI121-BvSPS重組質粒被成功地構建并轉化到農桿菌EHA105中。該重組的植物雙元表達載體被用于甜菜轉基因的研究。

2.2 甜菜BvSPS轉基因體系的優化

植物基因遺傳轉化過程錯綜復雜，其中各種轉化因子直接關系到基因的轉化效率。本研究著重從農桿菌的侵染濃度、侵染時間及共培養時間方面對甜菜轉基因體系進行了優化。如表1所示，當農桿菌侵染濃度OD600值為0.6，侵染時間5 min，共培養4 d后，甜菜葉柄外植體經過侵染后，其不定芽比率最高，約為36.6%、33.3%及38.3%。而侵染濃度和時間過高或過長，都會由于農桿菌生長頻率較快而導致甜菜葉柄死亡。

依據以上實驗結果，確定最適農桿菌濃度是OD600值為0.6，最適侵染時間為5 min，最佳共培養時間為4 d。

2.3 BvSPS轉基因植株的鑒定

剪取野生型及待測轉基因甜菜新鮮葉片，利用CTAB法提取甜菜基因組DNA，以提取的DNA為模板進行Kana抗性苗PCR擴增檢測。

如圖2所示，陽性質粒pBI121-BvSPS對照的擴增條帶最亮，野生型陰性對照沒有明顯擴增出特異性條帶。而待測8株轉基因植株則分別不同程度地擴增出了和陽性對照同等大小的目的條帶，這就證明BvSPS基因被不同程度地轉化并整合到甜菜基因組中。

圖1 pBI121-BvSPS植物表達載體的PCR鑒定

表1 甜菜轉基因體系的優化

圖2 轉基因甜菜的PCR檢測

3 討論

隨著甜菜產業的發展及人民生活水平的提高，傳統的遺傳改良方式已經無法滿足人們對糖制品的需求。利用轉基因技術提高甜菜含糖率成為最為快速有效的方法之一。甜菜基因工程在我國起步較晚，轉基因研究主要集中在甜菜的病害及抗除草劑方面[7－8]。本研究則利用分化率較高的、遺傳性狀穩定的和再生能力較強的遺傳轉化體系，建立高效而穩定的外源基因整合方法，并成功將BvSPS基因穩定而高效地轉化到甜菜基因組內。由于甜菜BvSPS基因存在于甜菜基因組內，轉基因植株檢測過程中，用于分子鑒定的PCR引物特殊設計了上游引物位于pBI121載體上的堿基序列，下游引物位于BvSPS基因內部，這就避免了檢測過程中假陽性的出現。轉基因植株也將進一步生根、栽培，所獲得的種子將進一步用于篩選、比較研究及實際應用。

[1]朱向明，韓秉進，張秋英，等.黑土區甜菜新品種間塊根產量與含糖率差異[J].土壤與作物，2012，1（2）：126-128.

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[5]Cumino A,Curatti L,Giarrocco L,et al.Sucrose metabolism：Anabaena sucrose-phosphate synthase and sucrose-phosphate phosphatase define minmal functional domains shuffled during evolution[J].FEBS Lett,2002,517（1-3）：19-23.

[6]劉大麗，馬龍彪，郝慧.甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析[J].中國糖料，2010（4）：6-8.

[7]劉大麗，馬龍彪，王皙瑋，等.應用 RT-PCR 技術檢測甜菜壞死黃脈病毒[J].中國糖料，2008（2）：12-17.

[8]孫亞卿，邵金旺，張少英.甜菜基因工程研究進展及其展望[J].中國農學通報，2007，23（4）：27-32.