煙曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表達及酶學性質分析

謝貽，歐陽浩淼，黃日波，陳東，金城

1 中國科學院微生物研究所 真菌學國家重點實驗室，北京 100101

2 廣西科學院非糧生物質酶解國家重點實驗室 國家非糧生物質能源工程技術研究中心 廣西生物煉制重點實驗室，廣西南寧 530007

β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase, EC3.2.1.21)在自然界分布廣泛，可催化水解 β-D-葡萄糖苷鍵，參與生物體的糖代謝，在人類、動植物和微生物的糖類代謝方面具有非常重要的價值[1-2]。

β-葡萄糖苷酶可以廣泛應用于多種工業領域，如在纖維素的降解中，輔助外切纖維素酶和內切纖維素酶將纖維素降解為葡萄糖單糖；在食品工業中作為食品改良劑，水解果汁飲料、酒、茶葉等中的芳香基糖苷類化合物，釋放風味前體物質，使香氣更加濃郁協調，顯著提高風味；在工業中，制備有活性的中藥成分，生產低聚龍膽糖、表面活性劑[3-4]；同時，與其他酶協同作用生產單細胞蛋白等，應用于飼料工業和醫藥領域。因此，尋找新的 β-葡萄糖苷酶具有重要意義。

煙曲霉是自然界普遍存在的一種腐生真菌，是已知真菌中唯一能在 30～55 ℃的范圍內正常生長的真菌，也是目前已知的熱耐受性最高的真核生物，相關文獻報道證明煙曲霉產生的多種酶均具有較好的熱穩定性，如幾丁質酶、植酸酶等[5-6]。因此，煙曲霉是一種非常好的工業用酶來源。

本研究克隆并表達了煙曲霉基因組中注釋的β-葡萄糖苷酶編碼基因bgl(AFUA_8G06970)，對重組蛋白的分析證明該基因編碼的蛋白是一個熱穩定性較好的、新型β-葡萄糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

煙曲霉Aspergillus fumigatusYJ-407由中國微生物保藏中心保存 (CGMCC 0386)，表達載體 pGEX-4T-1購自 Invitrogen公司，克隆載體pEASY-T1及大腸桿菌 DH5α和 BL21(DE3) 購自Transgen公司。

1.1.2 主要試劑和儀器

質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶、蛋白質Marker購自Fermentas公司；DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；用于酶學分析的底物均購自Sigma公司，其他試劑為國產分析純。GSTrap FF Column (GE公司)，超聲波細胞粉碎機 (南京新辰生物科技有限公司)；DU800紫外可見分光光度計 (Beckman公司)；蛋白電泳相關設備 (Bio-Rad公司)。

1.2 煙曲霉基因組DNA的提取

將煙曲霉孢子接種于完全培養基，37 ℃培養48 h后收集菌絲，菌絲加液氮研磨成細粉，用苯酚-氯仿法提取基因組DNA。

1.3 目的基因的克隆

1.3.1 引物設計

根據GenBank中預測的β-葡萄糖苷酶基因序列，用 Primer 5.0軟件設計引物 (Forward primer: 5'-GCGTCGAC TCATGAGACAGTGCG GTGAGTTG-3'；Reverse primer: 5'-ATTTGCGG CCG CCTACTTGGACATCCTCGATGAC-3')，并在其上下游引入酶切位點SalⅠ和NotⅠ (下劃線部分所示)。

1.3.2 bgl基因的擴增和TA克隆

PCR反應采用 25 μL體系，反應條件為：95 5 min℃ ，30個循環；72 10 min℃ ；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 2 min℃ 。PCR產物純化后與pEASY-T1載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，藍白斑篩選出陽性克隆，并經測序驗證。

1.4 融合表達載體的構建

pEASY-bgl和 pGEX-4T-1通過SalⅠ與NotⅠ雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，16 ℃連接過夜后轉化 DH5α，通過酶切驗證，最終得到表達載體pGEX-bgl。

1.5 重組載體在大腸桿菌中的誘導表達

pGEX-bgl轉化至E. coliBL21(DE3)，用七葉苷平板法快速篩選具有β-葡萄糖苷酶活性的重組菌株[7]。37 ℃過夜的培養物以轉接至LB培養基中，200 r/min培養2～3 h，加入異丙基-β-D- 硫 代 半 乳 糖 苷 (IPTG, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 于 16 ℃、200 r/min培養24 h。

1.6 親和層析純化及產物鑒定

將培養液5 000 r/min離心20 min，收集菌體，重懸于 1×PBS中，冰浴超聲裂解，離心收集上清。用GE公司的 GSTrap FF column (5 mL預裝重力柱) 于 AKTA Purifier 層析系統中純化上清中的重組蛋白。純化的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色，觀察結果，并切取目的條帶，經脫色、還原和烷基化后，膠內胰蛋白酶酶解，進一步處理后的肽提取液進行MALDI-TOF-MS檢測[8]。蛋白質定量采用Bradford法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白[9]。

1.7 酶學性質分析

以七葉苷作為底物，采用DNS比色法測定β-葡萄糖苷酶活性[10]。70 μL 0.1 mol/L 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中，加入20 μL 1%的七葉苷和10 μL酶液，在一定溫度和pH下反應10 min，立即加入100 μL DNS試劑，沸水浴5 min，流水冷卻至室溫，在波長540 nm下測吸光度，以相同處理的滅活酶作空白對照。一個酶活力單位(Unit)定義為每分鐘催化 1 μmol還原糖生成所需的酶量。所有酶活測定結果為 3次重復平行試驗數據的平均值。

1.7.1 溫度對酶活力的影響

在 25～65 ℃范圍內分別測定酶活力，反應條件為pH 5.8，10 min，以最高活力為100%。熱穩定性測定：在最適pH下，將濃度為0.2 mg/mL的酶分別于45 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃下水浴保溫0.5 h、1 h、2 h和 4 h后，加入底物于 45 ℃，pH 5.8測定殘留活力，以未處理的酶活力為100%，作溫度穩定性曲線。

1.7.2 pH對酶活力的影響

在45 ℃下測定pH值的變化對酶活力的影響，以最高活力為 100%，作 pH曲線。pH 穩定性的分析：在 4 ℃條件下將酶在不同 pH值(pH 2～8) 的緩沖液中處理過夜，然后在最適條件下測定酶活，以未處理的酶活力為100%，計算相對酶活，以研究其pH穩定性。

1.7.3 酶的動力學參數測定

以不同濃度的七葉苷為底物在最適條件下反應 5 min，采用雙倒數作圖法 (Line weaver?Burk) 計算Km及Vmax值。

1.7.4 金屬離子和化學試劑對酶活力的影響

在酶促反應中加入不同的金屬離子 (終濃度1 mmol/L) 和相關化學試劑 (終濃度 5 mmol/L)在最適條件下反應，研究其對酶活性的影響。以未加金屬離子和化學試劑的反應體系為正對照，計算其他各處理樣品的相對酶活力。

1.7.5 酶的底物特異性

采用水楊苷、熊果苷、羧甲基纖維素鈉、葡聚糖、纖維二糖為底物，在標準反應條件下反應10 min，用DNS法或葡萄糖氧化酶法測定吸光度值，根據葡萄糖標準曲線計算酶活。同時，以pNPG、pNPC、pNPX、oNPG為底物[11]，在標準反應條件下反應10 min，測定405 nm吸光值，根據 pNP標準曲線計算酶活。一個酶活力單位 (Unit) 定義為：在標準條件下，每分鐘產生1 μmol pNP所需要的酶量。

2 結果與分析

2.1 bgl的克隆和序列測定

通過 PCR 方法擴增到bgl的編碼框全長，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，可見一條約 1.7 kb 的 DNA 片段 (圖 1A)，該片段與預期 PCR 產物長度一致，說明已成功擴增出目的基因。連接T載體后的重組質粒經測序鑒定，序列與 GenBank 上的bgl基因片段完全相同。

2.2 表達載體的構建及活性菌株篩選

圖1 PCR擴增產物及表達載體的酶切鑒定Fig. 1 Amplification of the gene bgl and construction of expression vector. (A) M: DNA marker; 1: bgl. (B)M: DNA marker; 1: pGEX-bgl digested with SalⅠand NotⅠ.

按照材料和方法中所述構建重組表達質粒pGEX-bgl。重組質粒酶切得到約 5 kb的pGEX-4T-1線性片段和約 1.7 kb的插入片段，證明已經成功構建出原核表達載體 (圖1B)。將pGEX-bgl轉入BL21(DE3)，經初篩和復篩，選擇在七葉苷平板上能產生黑色活性圈的 β-葡萄糖苷酶產生菌 (圖2)。

2.3 重組蛋白的表達和純化

圖2 產β-葡萄糖苷酶陽性菌株的篩選Fig.2 Screening of β-glucosidase positive clones on Esculin agar plates.

對誘導進行優化，最終選擇以下條件：過夜培養菌液次日以 1:100體積比接種 LB培養基于37 ℃，放大培養至OD600=0.6時以終濃度為0.4 mmol/L IPTG，于16 ℃、200 r/min誘導24 h。誘導表達的重組蛋白經親和層析純化，獲得一個分子量約為 65 kDa的蛋白 (圖 3A)，與理論值相符。進一步通過質譜進行肽指紋圖譜鑒定 (圖3B)，證明所純化的重組蛋白為bgl基因編碼的蛋白。

圖3 重組β-葡萄糖苷酶純化的SDS-PAGE和質譜檢測題Fig. 3 Identification of recombinant protein by SDS-PAGE and mass spectrometry analysis. (A) SDS-PAGE analysis of the purified Bgl. M: prestained protein marker; 1: purified recombinant protein Bgl. (B) Mass spectrogram results of Bgl. peak 1 matched peptides of ‘‘FNDNFGVPR’’; peak 2 matched peptides of ‘‘SLFDLVDFVSSR’’; peak 3 matched peptides of ‘‘IVLTHFADR’’; peak 4 matched peptides of ‘‘TDLSDQLFDTPR’’.

2.4 純化重組酶的性質

2.4.1 溫度對酶活力的影響

該重組酶以七葉苷為底物的最適反應溫度為45 ℃，在25～40 ℃及50～60 ℃之間約有70%～80%的活性，65 ℃時僅表現出約 50%的活性 (圖4A)。純化的β-葡萄糖苷酶在最適溫度45 ℃活性保持穩定；70 ℃ 處理 1 h，其酶活殘留 80%以上，處理2 h，酶活性保持60%左右，處理4 h后酶活性殘留10%。80 ℃處理0.5 h，酶活保持50%以上 (圖4B)，表明該酶具有較好的熱穩定性。

圖4 溫度對酶活力和穩定性的影響Fig. 4 Effect of temperature on activities and stabilities of recombinant enzyme. (A) The optimal temperature of the Bgl was estimated at various temperatures (25 ℃?65 ℃) in sodium hydrogen phosphate-citric acid buffer(100 mmol/L, pH 5.8). (B) Purified enzyme (0.2 mg/mL)was incubated in different conditions (45 ℃, 60 ℃,70 ℃, 80 ℃ at optimal pH) for time 0.5 h, 1 h, 2 h, and 4 h. The activity of enzyme without pre-incubation was taken as 100%. Results are the average of three replicates.

2.4.2 pH對酶活力的影響

以檸檬酸-Na2HPO4體系作為緩沖液，酶活測定結果表明，酶于45℃時的最適pH在5.5～6.0之間 (圖5A)，屬于酸性酶。pH穩定性分析 (圖5B) 顯示，該酶在pH值4～6范圍內較穩定，超出這一范圍后，活性迅速下降。

圖5 pH對酶活力和穩定性的影響Fig. 5 Effect of pH on activities and stabilities of recombinant enzyme. (A) The optimal pH of the Bgl was estimated at various pH (3.0?8.0). (B) Purified enzyme was incubated at different pH (2.0?8.0) for 12 h, and the maximum activity was taken as 100%.

圖6 β-葡萄糖苷酶水解七葉苷的酶動力學曲線Fig. 6 Kinetic curve of Esculin hydrolyzed by recombinant enzyme.

2.4.3 酶促反應的動力學

重組酶在 45 ℃催化七葉苷水解時的動力學參數Km及Vmax值分別為 17.7 mmol/L和116 μmol/(min·mg)。

2.4.4 金屬離子和化學試劑對酶活力的影響

結果表明，Na+和Ca2+對重組酶有輕微的激活作用，Co2+和 Mg2+對酶促反應有不同程度的抑制作用，當反應體系中含有5 mmol/L的SDS時，酶已基本失去活性(圖7)。

2.4.5 底物特異性

分析了重組酶對多種底物的活性 (表 1)，發現重組 β-葡萄糖苷酶對七葉苷具有較高的活性，對水楊苷和纖維二糖活性相對較弱，而對其他底物分解能力很弱或不可測出。

圖7 金屬離子和化學試劑對酶活力的影響Fig. 7 Effect of different metal ions and chemical reagents on Bgl activity. Results are the mean of three replicates.

表1 β-葡萄糖苷酶的底物特異性Table 1 Hydrolytic specific activities of purified Bgl on various substrates

3 討論

根據氨基酸序列和CAZY數據庫的信息[12]，本研究克隆表達的蛋白隸屬于糖苷水解酶家族(Glycoside Hydrolysis Family)1。經 SWISSMODEL結構模擬分析，該酶與來源于黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium[13-14]的BGL1A具有30%的相似性；與土曲霉Aspergillus terreusβ-葡萄糖苷酶 (XP_001211835) 的同源性為 68%。同時與多種真菌，如里氏木霉Trichoderma reesei來源的GH1葡萄糖苷酶多序列比對發現，該酶具有兩個與催化活性有關Glu保守殘基。

已報道的 β-葡萄糖苷酶最適溫度在30～110 ℃之間，多為酸性酶 (表2)，我們得到的重組酶最適溫度和最適 pH也在此范圍內變化。值得一提的是，煙曲霉Bgl在70 ℃保溫1 h后仍可保留 80%以上的酶活性；80 ℃處理0.5 h，酶活保持在50%以上。因此，該酶在目前已報道的真菌GH1家族的β-葡萄糖苷酶中是熱穩定性最高的。

目前已報道的 β-葡萄糖苷酶大多可以分解纖維二糖，而Neosartorya fischeri來源的酶能有效分解槲皮黃酮葡萄糖苷、染料木黃酮等，卻不能分解纖維二糖、三糖和四糖；還有的酶分別對七葉苷、水楊苷等水解能力較強 (表 2)。對煙曲霉 Bgl的底物特異性進行分析發現，該酶對七葉苷活性最高，對水楊苷和纖維二糖有一定活性，但對其他商品化底物則沒有活性，與其他來源的 β-葡萄糖苷酶的底物特異性存在較大差異。由于所測試的底物有限，尚難以確定煙曲霉Bgl的天然底物，仍需進一步的深入研究。

表2 不同來源β-葡萄糖苷酶的部分酶學性質Table 2 Properties of recombinant BGLs from various sources

[1]Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial Rev,1995, 59(1): 143?169.

[2]Anish R, Rahmanm MS, Rao M. Application of cellulases from an alkalothermophilicThermomonosporasp. in biopolishing of denims.Biotechnol Bioeng, 2007, 96(1): 48?56.

[3]Yan TR, Liau JC. Synthesis of alkyl β-glucosidases from cellobiose withAspergillus nigerβ-glucosidase II. Biotechnol Lett, 1998, 20(7):653?657.

[4]Cortes ML, Felipe P, Martin V, et al. Successful use of a plant gene in the treatment of cancerin vivo.Gene Ther, 1998, 5(11): 1499?1507.

[5]Nierman WC, Pain A, Anderson MJ, et al. Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungusAspergillus fumigatus. Nature,2005, 438(7071): 1151?6.

[6]Wang Y, Wang JQ, Jin C, et al. Cloning and expression of chitinase gene fromAspergillus fumigatusYJ407. Chin J Biotech, 2004, 20(6):843?850 (in Chinese).

王穎, 王俊琦, 金城, 等. 煙曲霉幾丁質酶基因的克隆與表達. 生物工程學報, 2004, 20(6): 843?850.

[7]Edberg CE, Trepeta RW, Kontnick CM, et al.Measurement of active constitutive beta-D-glucosidase (Esculinase) in the presence of sodium desoxycholate. J Clin Microbiol, 1985, 21(3):363?365.

[8]Bergman AC, Benjamin T, Alaiya A, et al.Identification of gel-separated tumor marker proteins by mass spectrometry. Electrophoresis, 2001, 21(3):679?86.

[9]Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 7(72): 248?254.

[10]Liu DY, Zhang RF, Yang XM, et al. Expression,purification and characterization of two thermostable endoglucanases cloned from a lignocellulosic decomposing fungiAspergillus fumigatusZ5 isolated from compost. Protein Expr Purif, 2011,79(2): 176?186.

[11]Opassiri R, Hua Y, Wara-Aswapati O, et al.β-Glucosidase, exo-β-glucanase and pyridoxine transglucosylase activities of rice BGlu1. Biochem J,2004, 379(1): 125?131.

[12]Davies G, Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure, 1995, 3(9): 853?859.

[13]Nijikken Y, Tsukada T, Igarashi K, et al. Crystal structure of intracellular family 1 β-glucosidase BGL1A from the basidiomycetePhanerochaete chrysosporium. FEBS Lett, 2007, 581(7):1514?1520.

[14]Arnold K, Bordoli L, Kopp J, et al. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modeling. Bioinformatics, 2006, 22(2): 195?201.

[15]Harnpicharnchai P, Champreda V, Sornlake W, et al.A thermotolerant β-glucosidase isolated from an endophytic fungi,Periconiasp., with a possible use for biomass conversion to sugars. Protein Expr Purif,2009, 67(2): 61?69.

[16]Priyadharshini R, Manish Kumar, T, Raushan K, et al. Cloning and characterization of a putative β-glucosidase (NfBGL595) fromNeosartorya fischeri. Process Biochemistry, 2012, 47(1): 99?105.

[17]Rosi I, Vinella M, Domizio P. Characterization of β-glucosidase activity in yeasts of oenological origin.J Appl Bacteriol, 1994, 77(5): 519?527.

[18]Chen HL, Chen YC, Lu MJ, et al. A highly efficient β-glucosidase from the buffalo rumen fungusNeocallimastix patriciarumW5. Biotechnol Biofuels,2012.5: 24.

[19]Yan Q, Hua C, Yang S, et al. High level expression of extracellular secretion of a β-glucosidase gene(PtBglu3) fromPaecilomyces thermophilainPichia pastoris. Protein Expr Purif, 2012, 84(1): 64?72.

[20]Xu R, Teng F, Zhang C, et al. Cloning of a gene encoding β-glucosidase fromChaetomium thermophilumCT2 and its expression inPichia pastoris. J Mol Microbiol Biotechnol, 2011, 20(1):16?23.

[21]Zhao LG, You LJ, Meng P, et al. Study on purification and some properties of a highly glucose-tolerant extracellular β-glucosidase fromAspergillus niger. Chem Ind Forest Prod, 2007,27(6): 41?46 (in Chinese).

趙林果, 游麗金, 孟鵬, 等. 黑曲霉胞外耐高糖 β-葡萄糖苷酶的分離純化及部分特性研究. 林產化學與工業, 2007, 27(6): 41?46.

[22]Takashima S, Nakamura A, Hidaka M, et al.Molecular cloning and expression of the novel fungal β-glucosidase genes fromHumicola griseaandTrichoderma reesei. J Biochem, 1999, 125(4):728?736.