2,3-丁二醇代謝途徑關鍵酶基因敲除對克雷伯氏菌發酵產1,3-丙二醇的影響

郭欣坤，方慧英 ，諸葛斌，宗紅，宋健，諸葛健

1 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學 生物工程學院工業微生物研究室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122

1,3-丙二醇是一種三碳平臺化合物，是合成對苯二甲酸丙二醇酯、聚亞氨酯、聚醚、聚胺酯和芳香聚酯的重要單體[1-4]。自然界中能夠以甘油為底物生產1,3-丙二醇的菌主要有克雷伯氏菌Klebsialla、弗氏檸檬酸菌Citrobacter、乳桿菌Lactobacilli、梭菌Clostridia[5]等，其中克雷伯氏菌是生產強度和轉化率較高的菌種之一，其甘油代謝途徑分為還原途徑和氧化途徑：還原途徑生產1,3-丙二醇；氧化途徑提供生物生長所需的能量 (ATP)、生物量、還原當量 (NADH)，并形成2,3-丁二醇、乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醇等副產物。

2,3-丁二醇與 1,3-丙二醇都含有兩個羥基，具有高沸點和與水互溶的特點，在發酵液精餾分離過程中，隨著2,3-丁二醇在液相中含量的降低，其在汽相中的摩爾分率越來越小，需要采用更大的回流比才能分離提純1,3-丙二醇，從而造成分離成本增高[6]。此外，2,3-丁二醇的合成需要消耗大量碳源和還原力NADH[7]，致使依賴NADH合成的1,3-丙二醇的轉化率大大降低，所以降低發酵過程中2,3-丁二醇的產量成為一個需要解決的問題[8-9]。

利用基因敲除技術消除發酵過程中副產物產生是一種提高目的產物產量的有效策略[10-14]。2,3-丁二醇合成途徑中有 3種酶：α-乙酰乳酸合成酶 (α-acetolactate synthetase，ALS)、α-乙酰乳酸 脫 羧 酶 (α-acetolactate decarboxylase ，α-ALDC) 和 2,3-丁二醇脫氫酶 (2,3-BD dehydrogenase，BDH)[15-16]。這三個酶的基因位于budABC操縱子上，其中budB編碼α-乙酰乳酸合成酶，budA編碼α-乙酰乳酸脫羧酶，budC編碼2,3-丁二醇脫氫酶。在2,3-丁二醇代謝途徑中，α-乙酰乳酸合成酶可以催化丙酮酸形成 α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在 α-乙酰乳酸脫羧酶作用下形成3-羥基-2-丁酮，2,3-丁二醇脫氫酶催化3-羥基-2-丁酮形成 2,3-丁二醇 (圖 1)。本研究利用 Red同源重組技術[17]分別構建了budC和budA基因缺陷株，并通過發酵實驗考察這兩個基因的缺失對克雷伯氏菌發酵產 1,3-丙二醇的影響。

圖1 2,3-丁二醇的代謝途徑及相關酶[15]Fig. 1 Metabolism pathway of 2,3-butanediol and related enzymes[15]. E1: α-acetolactate synthase; E2: α-acetolactate decarboxylase; E3: 2,3-butanediol dehydrogenase.

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniaeZG25由本研究中心篩選并保藏。用于基因敲除所需要的工具質粒pKD13、pKD46和pCP20均購自美國耶魯大學大腸桿菌菌株庫。本研究中使用的引物見表1。

1.2 工具酶及試劑

質粒小量提取試劑盒、細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；TaqDNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司；氨芐青霉素 (Amp)、卡那霉素 (Kan)、氯霉素 (Cm) 購自上海朝瑞生物技術有限公司，2-乙酰氧基-2-甲基-乙酰乙酸乙酯購于Sigma公司；L-阿拉伯糖、monohydrate 2-(N-嗎啉代) 乙烷磺酸一水、Brij-35聚環氧乙烯月桂酰醚購自生工生物工程 (上海) 有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.3 培養基與培養方法

種子培養基 (g/L)：酵母提取物 5，胰蛋白胨10，NaCl 10。葡萄糖蛋白胨水培養基 (g/L)：胰蛋白胨5，葡萄糖5，K2HPO42。發酵培養基(g/L)：甘油 40，葡萄糖 5，酵母膏 5，KH2PO47.5，MgSO42，(NH4)2SO42，FeSO4·7H2O 0.005，VB120.015，微量元素溶液10 mL/L，KOH調pH值至8.5。微量元素溶液 (g/L)：ZnCl20.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.06，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl20.02，NiCl2·6H2O 0.025，Na2MoO4·2H2O 0.035。需要時加入 Amp (100 μg/mL)、Kan(50 μg/mL)、Cm (34 μg/mL)。

種子培養：1%接種量 (V/V)、37 ℃、180 r/min培養6～7 h。發酵培養：250 mL三角瓶、50 mL裝液量，4%接種量 (V/V)，37 ℃、100 r/min旋轉式搖床振蕩培養，實驗重復3次，取平均值；5 L發酵罐 (韓國BIOTRO公司，型號：BIOG-M)，裝液量2.5 L，37 ℃，初始甘油濃度20 g/L，轉速200～250 r/min，通氣量0.5 L/min。從 8 h起流加甘油使其保持在 20 g/L左右，直至 22 h，用10 mol/L的KOH控制pH保持在7.5。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 budC和budA基因的敲除

提取K. pneumoniaeZG25全基因組，根據Klebsiella pneumoniae342 (GenBank Accession No. NC011283) 分別設計budC和budA基因引物CJ1、CJ2和AJ1、AJ2，擴增budC和budA基因并連接 pMD18-T測序。根據測序結果設計引物C1、C2和 A1、A2 (表1)，其中下劃線部分為目標基因上下游約50 bp的同源臂序列，以pKD13的 DNA為模板，分別擴增目標基因打靶 DNA片段geneD50-Kan-geneD50。將pKD46質粒電轉入K. pneumoniaeZG25，接種至含有 Amp(1.4 mg/mL)的 LB液體培養基中，37 ℃培養至8～10 h，然后轉移至含有Amp (2.0 mg/mL) 的LB固體平板上12～15 h，篩選出含有pKD46質粒的菌體。將目標基因打靶 DNA片段電轉導入K. pneumoniaeZG25 (pKD46)，在加入 Kan的 LB固體平板上篩選轉化子，升溫至42 ℃培養12 h以去除pKD46質粒，將pCP20質粒電轉導入菌體細胞，30 ℃培養2 h，利用pCP20消除轉化子中Kan抗性基因，然后升溫至42 ℃培養12～16 h去除pCP20質粒[18-19]。

1.5 轉化子的驗證

將打靶DNA片段電轉后在Kan抗性平板上長出的轉化子用鑒定引物K1、K2；AJ1、AJ2；CJ1、CJ2；KZ1、KZ1’和 KZ2、KZ2’進行 PCR驗證。K1和 K2分別是 Kan抗性基因的上游引物和下游引物，CJ1、CJ2和AJ1、AJ2分別是基因bud C和bud A基因上游和下游片段。KZ1、KZ1’和 KZ2、KZ2’分別是 Kan抗性基因中間某段基因序列及其反向互補序列。

1.6 測定方法

1.6.1 生物量及代謝產物測定

發酵液中的菌體密度以分光光度計吸光值OD650表示。細胞干重根據經驗公式 1OD=0.25 g/L。發酵液中甘油、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙酸、乙醇、乳酸、琥珀酸的測定參考文獻[10]。

1.6.2 酶活測定

α-乙酰乳酸脫羧酶的測定參考文獻[15]，酶活單位定義為37 ℃下每分鐘由α-乙酰乳酸脫羧酶脫羧 α-乙酰乳酸產生 1 μmol 3-羥基-2-丁酮的酶量。

2,3-丁二醇脫氫酶的測定參考文獻[20]，酶活力定義為37 ℃下每分鐘轉化1 μmol NADH成為NAD+的酶量。

1.6.3 蛋白質含量測定

粗酶液蛋白質含量采用Bradford法[21]測定，以BSA為標準蛋白。

2 結果

2.1 budC和budA單基因缺失菌株的獲得

以質粒pKD13 NDA為模板，擴增出目標基因打靶 DNA 片段budCD50-Kan-budCD50和budAD50-Kan-budAD50，轉化至含 pKD46質粒的K. pneumoniaeZG25感受態中，同源重組后在Kan平板上初步篩選budC和budA基因缺失突變株。

將含有Kan抗性基因的budC缺失菌株進行菌落 PCR驗證，結果如圖 2所示。分別利用 4對引物 K1、K2；CJ1、CJ2；CJ1、KZ2’和 KZ2、CJ2對budC缺失菌進行菌落 PCR鑒定，budC基因缺失菌株可以得到 1 303 bp、1 394 bp、627 bp和790 bp大小片段，出發菌株僅CJ1、CJ2引物可擴增得到862 bp片段。含Kan抗性基因的budA缺失菌株的菌落PCR驗證如圖3所示。分別利用 4對引物 K1、K2；AJ1、AJ2；AJ1、KZ1’和AJ2、KZ1進行菌落PCR鑒定，budA基因缺失菌株可以得到1 303 bp、1 600 bp、752 bp和742 bp大小片段，出發菌株僅AJ1、AJ2可得到1 077 bp片段。DNA凝膠電泳的結果均與理論值相符，表明budC和budA基因敲除成功，將質粒pCP20轉化至budC和budA基因缺失菌中，將Kan抗性基因消除，獲得的budC基因缺失菌命名為K. pneumoniaeZG38 (budC)，獲得的budA基因缺失菌命名為K. pneumoniaeZG38(budA)。

圖2 budC基因缺失菌的菌落PCR鑒定Fig. 2 Identification of the budC knockout by colony PCR. M: DL2 000 DNA marker; 1, 3, 5, 7: mutant(budC) containing Kan resistance gene; 2, 4, 6, 8:parent strain.

圖3 budA基因缺失菌的菌落PCR鑒定Fig. 3 Identification of the budA knockout by colony PCR. M: DL2 000 DNA marker; 1, 3, 5, 7: mutant(budA) containing Kan resistance gene; 2, 4, 6, 8:parent strain.

兩株基因突變株的2,3-丁二醇脫氫酶酶活如圖4A所示，出發菌株在整個發酵階段都有酶活性。K. pneumoniaeZG38 (budC)沒有檢測出2,3-丁二醇脫氫酶酶活，說明K. pneumoniaeZG38(budC)的budC基因已經被成功敲除，同時發現發酵過程中 3-羥基-2-丁酮大量積累 (數據未列出)，在發酵5～15 h時發酵液中3-羥基-2-丁酮濃度約為出發菌株的120%，進一步說明因為budC基因的缺失，造成了3-羥基-2-丁酮在發酵液中大量積累。K. pneumoniaeZG3 (budA) 沒有檢測出 2,3-丁二醇脫氫酶活性，為budA基因的缺失提供了佐證。

兩株基因突變株的 α-乙酰乳酸脫羧酶酶活如圖4B所示，出發菌株在整個過程中都保持α-乙酰乳酸脫羧酶的活性。K. pneumoniaeZG38(budC) 的budC基因缺失造成3-羥基-2-丁酮積累的同時，α-乙酰乳酸脫羧酶的活性相比出發菌株提高了約20% (6～24 h)，K. pneumoniaeZG38(budA) 沒有檢測出α-乙酰乳酸脫羧酶活性，說明K. pneumoniaeZG38 (budA) 的budA基因已經被敲除。

圖 4 K. pneumoniae ZG25、K. pneumoniae ZG38(budC)、K. pneumoniae ZG38 (budA) 2,3-丁二醇脫氫酶 (A) 與 α-乙酰乳酸脫羧酶 (B) 比酶活曲線的測定Fig. 4 Time course of specific activity of BDH (A) and α-ALDC (B) in K. pneumoniae ZG25, K. pneumoniae ZG38 (budC ) and K. pneumoniae ZG38 (budA).

2.2 突變株的分批發酵性能

為了初步考察基因敲除對菌體生長和代謝產物的影響，本研究對出發菌株K. pneumoniaeZG25及構建的基因缺失菌K. pneumoniaeZG38(budC) 和K. pneumoniaeZG38 (budA)進行了搖瓶發酵實驗，結果表明，K. pneumoniaeZG38(budC) 和K. pneumoniaeZG38 (budA)的平均比生長速率 (2.07/h，0.583/h)和生長量 (圖 5) 均低于出發菌株 (2.22/h)，說明budC和budA基因的缺失抑制了菌體的生長，相比之下，budA基因的缺失對菌體的影響更加嚴重，在整個發酵過程中，K. pneumoniaeZG38 (budA) 的菌體量只有出發菌株的25%～35%。K. pneumoniaeZG38(budA) 的發酵結果顯示，菌體不產生 1,3-丙二醇和2,3-丁二醇，而其他副產物的產量明顯增加，乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的產量分別為出發菌株的6.6、2.7、2.1和1.8倍。

甘油測定結果表明 (圖 6)，K. pneumoniaeZG38 (budC) 利用甘油的能力稍弱于出發菌株，出發菌株 12 h時已經消耗大部分甘油，而K. pneumoniaeZG38 (budC) 到24 h才消耗大部分甘油，至發酵結束時殘留甘油含量與出發菌株殘留甘油含量都保持在相同的水平 (0.5～1 g/L)，而K. pneumoniaeZG38 (budA) 菌株利用甘油的能力降低，直至發酵結束時，發酵液中仍然殘留約30 g/L的甘油。

圖 5 K. pneumoniae ZG25、K. pneumoniae ZG38(budC) 和 K. pneumoniae ZG38 (budA) 的生長曲線Fig. 5 Time course of cell growth of K. pneumoniae ZG25, K. pneumoniae ZG38 (budC) and K. pneumoniae ZG38 (budA).

圖 6 K. pneumoniae ZG25 (A)、K. pneumoniae ZG38(budC) (B )和 K. pneumoniae ZG38 (budA) (C) 的搖瓶發酵Fig. 6 Shake-flask fermentations of K. pneumoniae ZG25 (A), K. pneumoniae ZG38 (budC) (B) and K.pneumoniae ZG38 (budA) (C). 1,3-PDO:1,3-propanediol; 2,3-BD: 2,3-butanediol.

發酵液代謝產物的分析結果如圖 6所示，K. pneumoniaeZG38 (budC) 的 1,3-丙二醇和2,3-丁二醇產量分別達到21.7 g/L和3.4 g/L，為出發菌株的111%和65.3%。與出發菌株相比，2,3-丁二醇產量明顯下降，此外，K. pneumoniaeZG38 (budC) 單位菌體的 1,3-丙二醇產率、摩爾轉化率達到 0.603 g/(L·h)和 0.682 mol/mol，分別為出發菌株的109%和112%。由此可知，budC基因敲除造成的 2,3-丁二醇脫氫酶缺失降低了2,3-丁二醇產量，并提高了1,3-丙二醇產量。

2.3 突變株的分批補料發酵

在搖瓶發酵實驗的基礎上進一步考察K. pneumoniaeZG38 (budC) 發酵生產 1,3-丙二醇的能力，在 5 L發酵罐中對出發菌株及K.pneumoniaeZG38 (budC) 進行了分批補料發酵實驗，發酵結果如表2所示。

表2 K. pneumoniae ZG25和K. pneumoniae ZG38 (budC) 的分批補料發酵結果Table 2 Fermentation results of fed-batch fermentation of K. pneumoniae ZG25 and K. pneumoniae ZG38(budC)

由表 2可以看出，K. pneumoniaeZG38(budC) 的 1,3-丙二醇濃度為 66.9 g/L，相比于出發菌株提高了10%，1,3-丙二醇產率、對甘油的摩爾轉化率也明顯增加。正如所預測的，2,3-丁二醇脫氫酶失活導致了2,3-丁二醇和乙醇產量的降低，分別降低了30.0%和75.9%。然而budC基因缺失菌卻產生了更多的乙酸、琥珀酸，表明budC基因的缺失可以導致流向 2,3-丁二醇途徑的碳流轉向乙酸和琥珀酸途徑。

3 討論

菌體代謝旁路途徑基因敲除往往會在一定程度上影響菌體的生長，這在許多關于克雷伯氏菌基因敲除研究中已經得到證實[10-11]。本研究中對budC基因和budA基因的敲除也得到了相同的結果。就發酵目的產物來說，budC基因缺失菌株2,3-丁二醇的產量只是比出發菌株降低了 30%，并沒有完全按照預測消除2,3-丁二醇的產生，表明克雷伯氏菌可能存在另一條2,3-丁二醇途徑，即2,3-丁二醇循環，這條途徑已經在枯草芽胞桿菌、蠟狀芽胞桿菌和尿素微球菌[22-23]中被發現，并且2,3-丁二醇循環的生理機制還沒有闡明，至今尚無關于K. pneumoniae2,3-丁二醇回補途徑的研究。

本研究利用基因敲除技術對K. pneumoniae2,3-丁二醇回補途徑進行了探索，如圖 7所示，當2,3-丁二醇途徑因budC基因缺失而被阻斷時，通向 2,3-丁二醇途徑的碳流通過節點 3-羥基-2-丁酮轉向 2,3-丁二醇的回補途徑生成 2,3-丁二醇，在這個過程中，乙酸作為回補途徑的中間代謝產物被大量形成，理論上1 mol 2,3-丁二醇形成的同時也會形成2 mol乙酸，在分批補料發酵過程中，乙酸的產量約是2,3-丁二醇產量的1.88倍 (表2)，與理論預測值基本吻合，從而有力的證實了克雷伯氏菌中可能存在2,3-丁二醇回補途徑，并且當主要合成途徑被阻斷后會通過此回補途徑合成2,3-丁二醇。

budA基因的缺失對菌體的生長和生理產生了明顯影響，2,3-丁二醇代謝途徑在微生物胞內有著重要的生理功能，它維持著細胞內NAD+/NADH平衡，3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二醇的轉化是一個可逆的生化反應，故2,3-丁二醇代謝途徑是細胞的一個還原力庫，它的存在可以自動調節胞內的氧化還原平衡，而budA基因的缺失則使其喪失了這一功能，使變異菌株在生長上受到抑制，代謝紊亂，甘油的還原途徑被抑制，氧化途徑中產生的 NADH消耗在糖酵解到三羧酸循環途徑的產物形成過程中，從而導致發酵過程中乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的產量成倍增加。這與Zhang等[24]報道的產酸克雷伯氏菌budA基因缺失菌株發酵結果相似，Zhang等將budA基因敲除后雖然菌體生長受到抑制，但卻提高了1,3-丙二醇的產量，說明 2,3-丁二醇合成途徑對1,3-丙二醇產量的影響在不同克雷伯氏菌中的表現是不同的。

圖7 2,3-丁二醇代謝途徑和2,3-丁二醇循環[22]Fig. 7 Metabolic pathway of 2,3-BD and the 2,3-BD cycle[22].

根據枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus和尿素微球菌Micrococcus urea公布的2,3-丁二醇循環途徑[22]推測，若budA基因被敲除則使得α-乙酰乳酸脫羧酶缺失，從而使3-羥基-2-丁酮完全無法合成，導致2,3-丁二醇兩條代謝途徑都被阻斷，最終無2,3-丁二醇產生，這與本研究結果完全一致?；诒狙芯縝udC和budA基因敲除和代謝產物分析的結果，可以推斷克雷伯氏菌中可能存在2,3-丁二醇回補途徑，且2,3-丁二醇循環是以3-羥基-2-丁酮為起點。有關2,3-丁二醇循環的研究結果為以后更加深入的研究提供了基礎。在以后的研究中，應該重點研究克雷伯氏菌的2,3-丁二醇循環途徑，找出該途徑的關鍵酶基因并嘗試敲除關鍵酶基因，以進一步降低2,3-丁二醇和增加1,3-丙二醇的產量。

[1]Liu HJ, Xu YZ, Zheng ZM, et al. 1,3-propanediol and its copolyments: research, development and industrialization. Biotechnol J, 2010, 5(11):1137?1148.

[2]Kurian JV. A new polymer platform for the future-Sorona from corn derived 1,3-propanediol. J Polym Environ, 2005, 13(2): 159?167.

[3]Kaur G, Srivastava AK, Chand S. Advances in biotechnological production of 1,3-propanediol.Biochem Eng J, 2012, 64: 106?118.

[4]Saxena RK, Anand P, Saran S, et al. Microbial production of 1,3-propanediol: recent developments and emerging opportunities. Biotechnol Adv, 2009,27(6): 895?913.

[5]Biebl H, Menzel K, Zeng AP, et al. Microbial production of 1,3-propanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 52(3): 289?297.

[6]Gao SL, Fang YJ, Qi YW. Prediction of vapor-liquid equilibrium by ASPEN PLUS software for water-2,3-butanediol. Zhejiang Chem Ind, 2007, 138: 25?28 (in Chinese).

高山林, 方云進, 戚一文. 用aspen plus軟件預測水-2,3-丁二醇汽液相平衡數據. 浙江化工, 2007,138: 25?28.

[7]Converti A, Perego P, Del Borghi M. Effect of specific oxygen uptake rate on Enterobacter aerogenes energetics: carbon and reduction degree balances in batch cultivations. Biotechnol Bioeng,2003, 82(3): 370?377.

[8]Xiu ZL, Zeng AP. Present state and perspective of downstream processing of biologically produced 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol,2008, 78(6): 917?926.

[9]Hao J, Xu F, Liu H, et al. Downstream processing of 1,3-propanediol fermentation broth. J Chem Technol Biotechnol, 2006, 81(1): 102?108.

[10]Zhang YP, Li Y, Du CY, et al. Inactivation of aldehyde dehydrogenase: A key factor for engineering 1,3-propanediol production byKlebsiella pneumoniae.Metab Eng, 2006, 8(6):578?586.

[11]Yang G, Tian JS, Li JL. Fermentation of 1,3-propanediol by a lactate deficient mutant ofKlebsiella oxytocaunder microaerobic conditions.Appl Microbiol Biotechnol,2007, 73(5):1017?1024.

[12]Xu YZ, Guo NN, Zheng ZM, et al. Metabolism in 1,3-propanediol fed-batch fermentation by a D-lactate deficient mutant ofKlebsiella pneumoniae.Biotechnol Bioeng, 2009, 104(5):965?972.

[13]Seo MY, Seo JW, Heo SY, et al. Elimination of by-product formation during production of 1,3-propanediol inKlebsiella pneumoniaeby inactivation of glycerol oxidative pathway. Appl Microbiol Biotechnol,2009, 84(3): 527?534.

[14]Guo NN, Zheng Z M, Mai YL, et al. Consequences of cps mutation ofKlebsiella pneumoniaeon 1,3-propanediol fermentation. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86(2): 701?707.

[15]Blomqvist K, Nikkola M, Lehtovaara P, et al.Characterization of the genes of the 2,3-butanediol operons fromKlebsiellaterrigenaandEnterobacter aerogenes. J Bacteriol, 1993, 175(5):1392?1404.

[16]Mayer D, Schlensog V, Bock A. Identification of the transcriptional activator controlling the butanediol fermentation pathway inKlebsiella terrigena. J Bacteriol, 1995, 177(18): 5261?5269.

[17]Wei D, Wang M, Shi JP, et al. Red recombinase assisted gene replacement inKlebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol, 2012,39(8): 1219?1226.

[18]Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coliK-12 using PCR products. PNAS, 2000, 97(12): 6640?6645.

[19]Baba T, Ara T, Hasegawa M, et al. Construction ofEscherichia coliK-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol, 2006, 2(1): 1?11.

[20]Wardwell SA, Yang YT, Chang HY, et al.Expression of theKlebsiella pneumoniaeCG21 acetoin reductase gene inClostridium acetobutylicumATCC 824. J Ind Microbiol Biot,2001, 27(4): 220?227.

[21]Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Ana Biochem, 1976, 72(1): 248?254.

[22]Juni E, Heym GA. A cyclic pathway for the bacterial dissimilation of 2,3-butanediol,acetylmethylcarbinol, and diacetyl I. General aspects of the 2,3-butanediol cycle. J Bacteriol,1956, 71(4): 425?432.

[23]Ui S, Hosaka T, Mizutani K, et al. Acetylacetoin Synthase as a Marker Enzyme for Detecting the 2,3-Butanediol Cycle. J Biosci Bioeng, 2002,93(2): 248?251.

[24]Zhang G, Yang G, Wang X, et al. Influence of blocking of 2,3-butanediol pathway on glycerol metabolism for 1,3-propanediol production byKlebsiella oxytoca. Appl Biochem Biotechnol,2012, 168(1): 116?128.