同源過表達fnr、pncB和fdhF對克雷伯菌產氫代謝的影響

王姝玉，王俊，徐莉，皮健，張后今，閆云君

華中科技大學生命科學與技術學院 分子生物物理教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074

隨著能源問題的日益突出，厭氧發酵制氫已成為當前能源領域的研究熱點。研究表明，通過分析產氫微生物的代謝網絡，調控其代謝途徑，構建高效產氫菌[1-4]，已成為提高產氫微生物產氫能力的有效途徑[5-7]。

克雷伯菌具有較大產氫潛力，易于培養，底物適應性強，受到研究者的廣泛關注[8-10]。其厭氧發酵存在兩種產氫途徑：一種是甲酸裂解產氫，由甲酸氫裂解酶 (Formate hydrogen lyase，FHL) 系統催化甲酸裂解產生氫氣；另一種是NADH途徑，微生物直接利用細胞內過剩的還原力產生氫氣[3,11]。FHL系統是由甲酸脫氫酶(FDH-H)，氫酶 (Hyd-3) 和電子傳遞鏈組成[12]。fdhF基因只有在厭氧發酵條件下才合成 FDH-H大亞基，過量表達能促進 FDH-H大亞基的合成，從而促進甲酸裂解生成氫氣[12]。同時，fnr基因編碼的產氫厭氧代謝全局轉錄調控因子FNR (延胡索酸和硝酸鹽還原反應調控蛋白)是一個介導氧對基因調控的蛋白因子。FNR蛋白是在厭氧條件下生長有關的蛋白，它不僅抑制了一些好氧條件下的基因表達，而且激活有利于厭氧生長的基因表達。在厭氧條件下，FNR蛋白能同時正向調控丙酮酸脫酸途徑和甲酸氫裂解途徑產氫[13-15]。在已有的大腸桿菌厭氧發酵產氫研究中，過表達fnr基因明顯提高氫氣產氫，表明丙酮酸和甲酸的厭氧代謝能正向調控提高產氫通量[16]。Fan等[16]研究了 FNR等正向轉錄調控因子在大腸桿菌中的過表達，發現過表達fnr基因的重組菌產氫量比野生菌提高5.5倍。

NADH/NAD+是重要的輔因子，在微生物細胞內參與了300多個氧化還原反應[4]。利用輔因子工程調控微生物細胞內NADH/NAD+代謝，不僅可有效調節微生物細胞的生長，而且還會影響微生物的代謝流[17]。Berrios-Rivera 將博伊丁假絲酵母Candida boidinii中依賴NAD的甲酸脫氫酶在大腸桿菌Escherichia coli中進行了異源表達，NADH生成效率得到了明顯提高[18]。純厭氧條件下，過量表達pncB基因促進NAD (H) 總量的生成，更多的生成NAD；而NAD的增加，加速了葡萄糖的氧化，從而生成NADH[19]。NADH合成過程如圖1所示。

圖1 NAD(H) 合成過程[3]Fig. 1 Process of NAD(H) synthesis[3].

pncB基因所表達的煙酸轉磷酸核糖激酶(NAPRTase) 為合成NAD(H) 過程的關鍵酶，過表達能改變微生物細胞內的氧化還原水平，并能促進依賴 NADH的相關代謝產物的合成[11]。Heuser等[3]在E. coli中同時過量表達pncB基因和NAD合成酶基因nadE，導致胞內NAD(H) 總量增加7倍，NADP(H) 總量增加2倍。

但截至目前，在克雷伯菌中未見有相關研究的報道。為此，本研究以實驗室篩選到的克雷伯菌Klebsiellasp. HQ-3為對象，利用簡并引物克隆了克雷伯菌厭氧發酵產氫代謝途徑的多種轉錄調控因子，并首次實現同源過表達，以研究其對克雷伯菌厭氧發酵產氫效率、細胞生長及代謝終產物的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

產氫菌克雷伯氏菌 (Klebsiellasp. HQ-3) 由本實驗室篩選保存，E. coliTop10 (F－，lacX74△ ，△(ara-leu)，rpsL (StrR)) 由本實驗室保藏，克隆載體 pMD18-T購自 TaKaRa公司，質粒 pET-28a(+) 購自 Novagen公司，并以卡那霉素 (kanamycin，Kan) 啟動子代替 pET-28a(+)中的 T7啟動子，構建適于克雷伯菌中同源表達外源基因的載體pET28a-Pkan。

1.2 主要試劑、培養基及儀器

TaqDNA聚合酶和 dNTP Mixture購自Fermentas公司；限制性內切酶Hind Ⅲ、SacⅠ、EcoRⅠ，DNA Ligation Kit Ver. 2.0均購自TaKaRa 公司；Plasmid Mini KitⅠ和 Gel Extraction Kit購自 Omega公司；酸洗玻璃珠購自 Sigma公司產品；酵母提取物和蛋白胨為Oxoid公司產品；瓊脂糖為GENE公司產品；DNA Marker DS5000購自廣東東盛生物有限公司；其他試劑均為國產分析純。所用引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

葡萄糖發酵產氫培養基 (/L)：葡萄糖15.0 g，酵母提取物2.0 g，胰蛋白胨5.0 g，NaCl 2.0 g，K2HPO41.5 g，MgCl2·6H2O 0.6 g，FeSO4·7H2O 0.2 g，微量元素液 10 mL，115 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。使用前加入過濾除菌的生物素溶液10 mL。

電轉儀 617BR1-06510購于 Bio-Rad pulse Xcel；氣相色譜儀GC-9750購買于溫嶺福立分析儀器有限公司；高效液相色譜儀采用 SSI 2300-525，購買于美國SSI公司。

1.3 克雷伯野生菌HQ-3的fnr、pncB、fdhF基因擴增

在 GenBank中檢索肺炎克雷伯菌K. pneumoniae342、大腸桿菌E. colik-12、產氣腸桿菌Enterobacter aerogenesKCTC2190、陰溝腸桿菌E. cloacae、鼠類檸檬酸桿菌Citrobacter rodentium的產氫厭氧代謝的全局轉錄調控因子 FNR編碼基因fnr，設計簡并引物fnr1/fnr2。同樣，根據 GenBank中的煙酸轉磷酸核糖激酶 (NAPRTase) 編碼基因pncB序列、甲酸脫氫酶 FDH-H編碼基因fdhF序列分別設計簡并引物pncB1/pncB2和fdhF1/fdhF2。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列見表1。

表1 本實驗所使用的引物Table 1 Primers used in this study

以Klebsiellasp. 總DNA為模板，PCR擴增基因fnr、pncB、fdhF。產物回收后連接pMD18-T載體，轉化E. coliTop10感受態細胞，以100 μg/mL氨芐青霉素 (Amp) 的LB平板篩選陽性克隆子。酶切驗證，送上海生工測序，重組質粒分別命名為 pMD-fnr、pMD-pncB和pMD-fdhF。

1.4 重組質粒的構建

pMD-fnr、pMD-pncB和 pMD-fdhF經雙酶切，與同樣酶切的表達載體pET28a-Pkan連接，產物轉化E. coliTop10感受態細胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的 LB平板培養過夜，菌落PCR及 DNA序列測序驗證，得到重組質粒pET28a-Pkan-fnr、pET28a-Pkan-pncB、pET28a-Pkan-fdhF。表達載體構建流程如圖2。將表達質粒 pET28a-Pkan-fnr、pET28a-Pkan-pncB、pET28a-Pkan-fdhF及空載質粒 pET28a-Pkan分別電轉化Klebsiellasp. HQ-3感受態細胞，以卡那霉素平板篩選陽性重組子，菌落 PCR及雙酶切驗證，獲得相應的基因工程菌。

1.5 重組克雷伯菌批次發酵

將 3種重組菌株和對照菌株分別接種于 LB培養基，37 ℃培養12 h后，按20% (V/V) 的比例接種于含70 mL產氫培養基的150 mL錐形瓶中，用鹽水塞封口后，持續通純氮氣10 min，以排盡氧氣。將加有同種型號轉子的錐形瓶放入恒溫水浴磁力攪拌器中，37 ℃恒溫培養，采用帶有精確刻度的集氣裝置，利用排水法每隔2 h收集一次氣體，直至產氫完全終止。每組設置3個平行，每樣重復3次。

圖2 表達載體構建圖譜Fig. 2 Schematic illustration of pET28a-Pkan expression vector construction.

1.6 SDS-PAGE電泳檢測

將發酵液以8 000 r/min離心2 min，收集菌體，加入5 mL PBS緩沖液，振蕩重懸并置于冰浴中，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液與同體積的 2×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，沸水水浴5 min，用于SDS-PAGE電泳分析。

1.7 發酵及代謝產物分析

細胞生長以OD600吸光值表示。對數期的種子以1% (V/V) 濃度接種于LB液體培養基中，37 ℃恒溫培養，每隔2 h取出菌液測定OD600，延續14 h，繪制生長曲線，比較對照菌株與工程菌株的生長特性。產氫發酵液中的還原糖含量以3,5-二硝基水楊酸法 (DNS) 測定[20]；發酵液pH以pH計測定。

利用 GC-9750型氣相色譜儀測定發酵氣體中氫氣含量。氮氣作載氣，流速為55 mL/min，色譜柱填料為 carboxen-1004，80～100目，擔子為13 X分子篩，柱長2 m，TCD檢測器，進樣器、柱溫和檢測器分別為70 ℃、50 ℃、80 ℃，六通閥為1 mL定量管。外標法測定氫氣含量。

將發酵液12 000 r/min離心10 min，收集上清液，0.45 μm的濾膜過濾，以 SSI2300-525高效液相色譜法 (HPLC) 檢測發酵液中代謝產物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇等的含量。分析條件為：色譜柱為阿波羅 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相 20 mmol/L KH2PO4，pH 2.3，流速0.5 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，進樣量為5 μL。

2 結果與分析

2.1 基因的PCR擴增及序列測定

以Klebsiellasp. HQ-3基因組DNA為模板，擴增得到的目的基因片段大小分別約 750 bp、1 700 bp和1 200 bp，與預期相符。DNA測序分析表明，成功克隆到Klebsiellasp. HQ-3中fnr、fdhF、pncB全長基因，其開放閱讀框 (Open Reading Frame，ORF) 全長分別為 753 bp、1 680 bp和 1 203 bp。3條基因序列在 GenBank上注冊的登錄號分別為Accession No. KC183718，Accession No. KC183719和 Accession No.KC183717。

2.2 重組質粒的構建與驗證

以重組菌中的表達質粒為模板，進行 PCR驗證，擴增產物大小與預期值相符 (圖 3A)。以SacⅠ/Hind Ⅲ雙酶切驗證，pET28a-Pkan-fnr和pET28a-Pkan-pncB構建成功。EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切表明pET28a-Pkan-fdhF構建成功 (圖3B)。重組菌株分別命名為 HQ-3-fnr，HQ-3-pncB，HQ-3-fdhF及對照菌株HQ-3-C。

2.3 fnr、pncB和 fdhF基因在克雷伯菌中過表達

重組菌株經細胞破碎、離心，取等量上清進行SDS-PAGE電泳分析，以克雷伯菌HQ-3-C作對照 (圖4)。fnr、pncB和fdhF基因所表達的目的蛋白量較對照有增加，大小一致，表明fnr、pncB和fdhF基因均在Klebsiellasp. HQ-3中實現了過表達。

2.4 重組菌批次發酵性能分析

在14 h批次厭氧產氫發酵中，培養基pH值隨發酵時間逐漸降低，如圖5所示。由于在產氫過程中同時伴有代謝產物有機酸的生成，但重組菌培養基pH值降低較對照菌株慢。發酵終止后，發酵液的最終pH維持在4.7左右。

圖3 重組質粒的驗證Fig. 3 Confirmation of recombinant plasmids. (A) PCR amplification verification. M: DNA marker (DS 5 000); 1:PCR product of pET28-pkan-fnr from HQ-3-fnr; 2: PCR product of pET28-pkan-pncB from HQ-3-pncB; 3: PCR product of pET28-pkan-fdhF from HQ-3-fdhF. (B) Restriction analysis of recombinant plasmids. M: DNA marker (DS 5 000); 1: SacⅠ/HindⅢ digestion verification of pET28-pkan-fnr vector from HQ-3-fnr; 2: SacⅠ/Hind Ⅲ digestion verification of pET28-pkan-pncB vector from HQ-3-pncB; 3: EcoRⅠ/HindⅢ digestion verification of pET28-pkanfdhF vector from HQ-3-fdhF.

圖 4 fnr、pncB、fdhF基因在克雷伯氏菌中表達的SDS-PAGE電泳分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the expression of fnr,pncB, fdhF gene in Klebsiella sp. HQ-3. M: protein marker; 1: supernatant fluid of cell lysate from HQ-3-C;2: supernatant fluid of cell lysate from HQ-3-fnr; 3:supernatant fluid of cell lysate from HQ-3-pncB; 4:supernatant fluid of cell lysate from HQ-3-fdhF.

各菌株的生長曲線見圖6。重組菌株的生長比對照菌株略有減慢，但整體差別并不顯著?？赡苁怯捎诒M管因代謝因子的過表達導致菌株代謝網絡發生了一些改變，但該代謝支路在菌體生長代謝中并非起主導作用，因此對重組菌的生長影響有限。

圖5 對照菌株與重組菌株隨時間的pH變化比較Fig. 5 Comparison of time course of pH between HQ-3-C and the recombinants.

在厭氧批次發酵中，菌株隨發酵時間的累積產氫量如圖7所示?？梢钥闯?，隨著發酵時間的延長，累積產氫量也在不斷增加。在發酵初期的6 h內，工程菌的產氫量與對照菌株無顯著差別。對照菌株在8 h后累積產氫量趨于穩定，而工程菌在后期仍有較高的發酵產氫能力，12 h后累積氫產量才開始趨于穩定。3株工程菌的產氫量較對照菌株HQ-3-C相比均有不同幅度的提高。其中工程菌 HQ-3-fnr的累積產氫量最大，達58.1 mmol/L。

圖 6 對照菌株與重組菌株隨時間的細胞生長過程比較Fig. 6 Comparison of time course of cell growth (in term of OD600) between HQ-3-C and the recombinants.

圖7 對照菌株與重組菌株隨時間的累積產氫量比較Fig. 7 Comparison of time course of cumulative H2 production between HQ-3-C and the recombinants.

2.5 代謝產物分析

克雷伯菌葡萄糖厭氧發酵代謝見圖8。以高效液相色譜分別檢測了對照菌株及重組菌株搖瓶培養的發酵液組分，以 DNS法測定還原糖消耗量。表2顯示了發酵14 h后工程菌株和對照菌株培養基中剩余葡萄糖量及各代謝終產物的濃度。從中可以看出，3種工程菌株的葡萄糖消耗能力均高于對照菌株，HQ-3-fnr具有最高的葡萄糖利用效率，較對照菌株高出21.7%。

同樣，細胞外代謝終產物也有較大變化。葡萄糖厭氧發酵過程中，產生的甲酸量等于乙酸生成量與乙醇生成量之和。通過表2中代謝產物的分析可知，工程菌HQ-3-fnr與HQ-3-fdhF在代謝過程中產生的甲酸量明顯高于對照菌株，這是因為fnr、fdhF基因過表達促進了甲酸裂解產生氫氣，與此同時，也促進了上游丙酮酸向甲酸的轉化，從而表觀上甲酸量增加。而工程菌發酵液中甲酸的最終含量減少，說明工程菌消耗了較多甲酸生成氫氣，這也與實驗中工程菌氫氣產量增多相一致。

同時可以看出，HQ-3-pncB發酵液中乙醇和琥珀酸含量有增加，而乳酸的含量減少。pncB基因過表達使 NAD(H) 總量明顯增加，而NADH/NAD+比例下降，進而使細胞代謝流重新分配[3,22-23]。在整個發酵過程中，代謝流向著消耗 NADH較多的途徑，乙醇和琥珀酸的合成均需要消耗2 mol NADH，而乳酸合成僅消耗1 mol NADH。因此，本研究所使用的策略，在促進了產氫的同時，使代謝更偏于合成乙醇和琥珀酸方向。

圖8 克雷伯菌葡萄糖厭氧發酵代謝過程[21]Fig. 8 Anaerobic fermentation metabolic process of glucose in Klebsiella sp. HQ-3[21].

2.6 重組克雷伯氏菌產氫特性的測定

厭氧代謝產氫過程中，總產氫量由所消耗的葡萄糖轉化而來。表 2表明同源表達fnr、fdhF與pncB基因的工程菌葡萄糖消耗量比對照菌株均有明顯增加。研究認為，總產氫量是由甲酸裂解途徑產氫與 NADH途徑產氫的總和[24]。圖 9顯示出對照菌株與重組工程菌株厭氧發酵總產氫量，甲酸裂解途徑產氫量及NADH途徑產氫量之間的關系。從中可以看出，工程菌株HQ-3-fnr、HQ-3-pncB和 HQ-3-fdhF總產氫量較對照菌株均有所提高，每 mol葡萄糖中累積產氫量由0.991 mol 分別提高到 1.113 mol、1.106 mol、1.063 mol，分別提高了 12.26%、11.62%和7.28%。

同樣，工程菌株中由甲酸裂解途徑產生的氫氣量較對照菌株也有明顯增加，因為fnr基因正向調控甲酸裂解產氫，而fdhF基因編碼的甲酸脫氫酶則是作為甲酸氫裂解酶系統 FHL的重要組分影響著甲酸裂解產氫代謝過程。pncB基因編碼煙酸轉磷酸核糖激酶能促進 NADH途徑中NAD+與NADH合成，當細胞內還原力過剩時，細菌一般會利用多余的還原力生成氫氣，以維持細胞內平衡的氧化還原態[16,25]。但本研究發現，pncB基因的過量表達并未提高NADH途徑中氫氣的產量，而是使甲酸裂解途徑的產氫量升高，可能的原因是 NADH的增加促進了乙醇含量的升高，而使細胞中產生的甲酸量增加，從而促進了甲酸裂解產氫[26]。

表2 對照菌株與工程菌株葡萄糖消耗及代謝產物分析Table 2 Analysis of consumed substrate and anaerobic metabolic after 14 h cultivation of HQ-3-C and various mutants

圖9 表達菌株和對照菌株的產氫特性比較Fig. 9 Comparison of hydrogen production in wild type and recombinant strains.

3 結論

本文首次通過同源過表達雷伯菌代謝正調控因子fnr、pncB和fdhF基因，構建高效產氫基因工程菌。厭氧發酵結果表明，相較含空質粒的對照菌株，工程菌產氫量均有提高，底物產氫效率分別由原來每mol葡萄糖產的0.991 mol提高到 1.113 mol、1.106 mol和 1.063 mol。進一步對發酵后葡萄糖的消耗量、菌株生物量，以及厭氧發酵代謝產物的分析顯示，基因過表達工程菌中代謝產物的變化幾乎一致，菌株 HQ-3-fnr與HQ-3-fdhF發酵液中乙酸和乙醇的總和 (即甲酸量) 較對照菌株 HQ-3-C有明顯增加，而在發酵過程中工程菌的甲酸利用率更高，導致最終發酵液中甲酸含量較HQ-3-C減少，甲酸裂解途徑中的產氫量增加。工程菌HQ-3-pncB中，產生較多的 NADH使代謝向著消耗還原力的方向，因此乳酸含量降低，乙醇與琥珀酸含量增高。本研究提示，在厭氧發酵過程中，過表達代謝調控因子可促進產氫途徑中相關酶的活性，進而提高細菌的產氫能力，是一種提高厭氧發酵產氫的潛在技術手段。

[1]Show KY, Lee DJ, Tay JH, et al. Biohydrogen production: Current perspectives and the way forward. Int J Hydrogen Energy, 2012,37(20):15616?15631.

[2]Fan Z, Yuan L, Chatterjee R. Increased hydrogen production by genetic engineering ofEscherichia coli. PLoS ONE, 2009, 4(2): e4432.

[3]Heuser F, Schroer K, Lütz S, et al. Enhancement of the NAD(P)(H) pool inEscherichia colifor biotransformation. Eng Life Sci, 2007, 7(4):343?353.

[4]Ying W. NAD+and NADH in cellular functions and cell death. Front Biosci, 2006, 11(9):3129?3148.

[5]Zhang C, Lv FX, Xing XH. Bioengineering of theEnterobacter aerogenesstrain for biohydrogen production. Bioresour Technol, 2011, 102(18):8344?8349.

[6]Kumar N, Das D. Enhancement of hydrogen production byEnterobacter cloacaeIIT-BT 08.Process Biochem, 2000, 35(6): 589?593.

[7]Tanisho S, Ishiwata Y. Continuous hydrogen production from molasses by the bacteriumEnterobacter aerogenes. Int J Hydrogen Energy,1994, 19(10): 807?812.

[8]Bai LP, Wua XB, Jiang LJ, et al. Hydrogen production by over-expression of hydrogenase subunit in oxygen-tolerantKlebsiella oxytocaHP1.Int J Hydrogen Energy, 2012, 37(17):13227?13233.

[9]Xu FC, Hong HS. Effects ofadhEGene knock-out on hydrogen evolution ofKlebsiella oxytocaHP1.Acta Sci Nat Uni Sunyatseni, 2007, 46(1): 327?328(in Chinese).

徐方成, 洪華生.Klebsiella oxytocaHP1乙醇脫氫酶基因敲除對產氫的影響. 中山大學學報, 2007,46(1): 327-328.

[10]Zhu JB. Construction ofKlebsiella oxytocaHP1 mutants by homologous recombination to enhance hydrogen evolution [D]. Xiamen: Xiamen University, 2007 (in Chinese).

朱俊波. 產酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca)HP1高效產氫工程菌的構建[D]. 廈門: 廈門大學, 2007.

[11]Berríos-Rivera SJ, San KY, Bennett GN. The effect of NAPRTase overexpression on the total levels of NAD, the NADH/NAD+ratio, and the distribution of metabolites inEscherichiacoli. Metab Eng,2002, 4(3): 238?247.

[12]Self WT, Hasona A, Shanmugam KT. Expression and regulation of a silent operon, hyf, coding for hydrogenase 4 isoenzyme inEscherichia coli. J Bacteriol, 2004, 186(2): 580–587.

[13]Salmon K, Hung SP, Mekjian K, et al. Global gene expression profiling inEscherichia coliK12.The effects of oxygen availability and FNR. J Biol Chem 2003, 278(32): 29837?29855.

[14]Perrenoud A, Sauer U. Impact of global transcriptional regulation by ArcA, ArcB, Cra, Crp,Cya, Fnr, and Mlc on glucose catabolism inEscherichia coli. J Bacteriol, 2005, 187(9):3171?3179.

[15]Constantinidou C, Hobman JL, Griffiths L, et al. A reassessment of the FNR regulon and transcriptomic analysis of the effects of nitrate,nitrite, NarXL, and NarQP asEscherichia coliK12 adapts from aerobic to anaerobic growth. J Biol Chem, 2006, 281(8): 4802?4815.

[16]Fan Z, Yuan L, Chatterjee R. Increased hydrogen production by genetic engineering ofEscherichia coli. PLoS ONE, 2009, 4(2): e4432.

[17]San K, Bennett GN, Berr?os-Rivera SJ, et al.Metabolic engineering through cofactor manipulation and its effects on metabolic flux redistribution inEscherichia coli. Metab Eng,2002, 4(2): 182?192.

[18]Berrios-Rivera SJ, Bennett GN, San KY. Metabolic engineering ofEscherichia coli: Increase of NADH availability by overexpressing an NAD+-dependent formate dehydrogenase. Metab Eng, 2002, 4(3):217?229.

[19]Liang LY, Liu RM, Wang GM, et al. Regulation of NAD(H) pool and NADH/NAD+ratio by overexpression of nicotinic acid phosphoribosyltransferase for succinic acid production inEscherichia coliNZN111. Enzyme Microb Technol, 2012, 51(5): 286?293.

[20]Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem, 1959,31(3): 426?428.

[21]Converti A, Perego P. Use of carbon and energy balances in the study of the anaerobic metabolism ofEnterobacter aerogenesat variable starting glucose concentrations. Appl Microbiol Biotechnol,2002, 59(2–3): 303?309.

[22]Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains ofEscherichia coli. Appl Environ Microb, 2002,68(4): 1715?1727.

[23]Berríos-Rivera SJ, San KY, Bennett GN. The effect of NAPRTase overexpression on the total levels of NAD, the NADH/NAD+ratio, and the distribution of metabolites inEscherichia coli. Metab Eng,2002, 4(3): 238?247.

[24]Lu Y, Zhao HX, Zhang C. Expression of NAD+-dependent formate dehydrogenase inEnterobacter aerogenesand its involvement in anaerobic metabolism and H2production.Biotechnol Lett, 2009, 31(10): 1525?1530.

[25]Niu K, Zhang X, Tan W, et al. Effect of culture conditions on producing and uptake hydrogen flux of biohydrogen fermentation by metabolic flux analysis method. Bioresour Technol, 2011,102(15): 7294?7300.

[26]Zhang C, Ma K, Xing XH. Regulation of hydrogen production ofEnterobacter aerogenesby external NADH and NAD+. Int J Hydrogen Energy, 2009,34(1/3): 1226?1232.