薏苡仁油脂質體包封率測定方法研究

雷筱芬，劉玉珍（江西工業貿易職業技術學院，江西南昌330038）

薏苡仁（Coix lachryma-jobi L.var mayuen（Roman）stapf）是禾本科（Gramineae）薏苡屬（Coix L.）草本植物薏苡的干燥成熟種仁，是藥膳兩用原料，具有健脾、補肺、清熱、利濕的功效，《本草綱目》稱其為上品養心藥[1]。薏苡仁中含有約2%～7%左右的薏苡仁油、薏苡仁酯、植物固醇等多種成分?，F代藥理學研究表明，薏苡仁油具有抗腫瘤、免疫調節、抗病毒等方面的活性[2]。由于薏苡仁油中不飽和脂肪酸含量超過80%，易氧化，不但降低了其營養效價，而且極易導致食品安全問題。將薏苡仁油制備為脂質體，不但提高了其穩定性，而且可以實現靶向輸送[3]。包封率一直是脂質體研究的熱點，測定方法主要分為兩種：一種是直接測定，另一種是將游離藥物與脂質體分離后測定。常用的分離方法有透析法、柱層析法，離心法。由于包封率的測定次數十分頻繁，柱層析所需時間較長，操作過于繁瑣，且凝膠柱不適用于油脂的層析；冷凍超速離心只適于分離少量的小脂質體（約10nm以下）[4]。測定方法也不盡相同，有紫外分析、氣相分析、高效液相分析等[5-7]。本實驗擬采用透析法研究和測定薏苡仁油脂質體的包封率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆卵磷脂 上海源聚生物科技有限公司；膽固醇，BR級 上海政翔化學試劑研究所；薏苡仁油 廣州合誠三先生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），pH6.8 按《中華人民共和國藥典》2005年版標準配制；其余試劑 均為國產分析純。

JB-3定時恒溫磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司；JYT-10天平 上海醫用激光儀器廠；R205旋轉蒸發儀 上海申生科技儀器廠；紫外可見光分光光度計 日本島津公司；紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；透析袋14000 國藥集團化學試劑有限公司；超聲波發生器 上海必能信超聲有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薏苡仁油含量測定方法的建立 采用薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇的紫外掃描法分析[8]。

分別稱取0.2g薏苡仁油、0.2g卵磷脂、0.2g膽固醇，用石油醚溶解并轉移至100mL容量瓶中，定容，然后掃描其最大吸收波長。

1.2.2 薏苡仁油脂質體的制備[9]采用薄膜-超聲法制備薏苡仁油脂質體。精密稱取一定比例的卵磷脂、膽固醇、薏苡仁油于小燒瓶內，加入適量無水乙醚，搖動使其完全溶解，旋轉蒸發除去乙醚，形成均勻類脂薄膜；向小燒瓶中加入pH6.8的磷酸鹽緩沖液，超聲處理（時間30min，功率90W，90%）即得薏苡仁油脂質體混懸液，置冰箱4℃保存?？瞻字|體的制備則稱取等量脂質溶于乙醇，其余步驟同薏苡仁油脂質體的制備。

1.2.3 薏苡仁油脂質體破壁方法與破壁后混合物的分離純化

1.2.3.1 破乳劑種類的篩選 以乙醇、甲醇和Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）為破乳劑進行考察。精密移取脂質體混懸液1mL，置于25mL容量瓶中，加入其中一種破乳劑5mL，混勻，超聲破乳30min，加入50mL石油醚溶解，測定其吸光度，并分別測定同一批次空白脂質體的吸光度作為各自空白對照。

1.2.3.2 超聲破壁時間考察 采用超聲破壁并結合破乳劑的方法進行脂質體破壁，測定其包封率?？疾觳煌晻r間（10、20、30、40min）對脂質體的破壁效果。

1.2.3.3 薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇的溶解特性及薏苡仁油的分離 考察薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇在石油醚、冷乙醇及熱乙醇中的溶解特性；用溶劑分離法分離薏苡仁油。

1.2.4 薏苡仁油石油醚標準曲線的繪制及其脂質體包封率的測定[10]

1.2.4.1 采用日本島津的紫外可見分光光度計 掃描薏苡仁油石油醚溶液的最大吸收波長；配制不同濃度的薏苡仁油標準溶液，分別在最大吸收波長下測定其吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

本實驗采用透析法除去未包封的薏苡仁油，加入破乳劑結合超聲法使包封薏苡仁油游離出來，并測定其吸光度，進而換算出質量。包封率EE（%）計算公式如下：

式中，Wlip為脂質體中包封薏苡仁油的量；Wtot為脂質體混懸液中薏苡仁油總量。

1.2.4.2 透析時間的確定實驗 分別量取20mL新制備的脂質體混懸液裝入6個透析袋中，扎口后放入燒杯中以磷酸鹽緩沖液回流。分別于10、12、14、16、18、20h取出透析后的脂質體，測定其包封率。

1.2.4.3 分離法精密度考察 對同一批薏苡仁油脂質體分別3次取樣透析，平行分離，分離后將袋中溶液倒入100mL容量瓶，加入破乳劑，結合超聲破壁（30min，功率90W，80%[9]），加入石油醚提取，將混合溶液進行離心（3000r/min，3min），取10mL上清液于25mL容量瓶中，用有機溶劑定容，測定其吸光度A，計算精密度。

1.2.4.4 回收率實驗 精密稱取薏苡仁油適量，加入空白脂質體中，分離后收集薏苡仁油溶解液10mL置于25mL容量瓶中，定容，測定其吸光度A，計算回收率。

2 結果與討論

2.1 薏苡仁油、卵磷脂和膽固醇的紫外掃描和紫外掃描分析方法可行性

紫外掃描等分析方法測定各類脂質體包封率已有報道；仵文英、徐云龍等[8，10-11]利用空白脂質體和脂質體芯材的最大吸收波長不同，通過紫外分光光度法測定頭孢他啶和茶樹油脂質體包封率；晏亦林等[12]采用Sephadex G-50凝膠柱分離脂質體和游離磷酸川芎嗪，紫外分光光度法測定磷酸川芎嗪納米脂質體包封率和滲漏率。紫外法測定薏苡仁油包封率的原理是通過測定薏苡仁油溶液對檢測波長入射光的吸光度，由朗伯-比爾定律求得薏苡仁油的含量，對脂質體破壁前后薏苡仁油進行定量比較。

薏苡仁油、卵磷脂和膽固醇的掃描結果見圖1。

圖1 光譜掃描曲線Fig.1 Ultraviolet scanning spectrum

由圖1可知，在220～330nm波長范圍內，薏苡仁油的吸收峰較大，而卵磷脂的吸光度在220～300nm范圍內也較大，膽固醇在210nm附近也有一較小的吸收峰，脂材對薏苡仁油的紫外測定存在干擾。晏亦林等[12]發現脂材對磷酸川芎嗪的紫外測定存在干擾時，采用測定游離磷酸川芎嗪的量來間接計算脂質體的包封率。由于本研究采用透析法分離游離薏苡仁油，需不時更換透析液，不適宜測定游離薏苡仁油的含量，故直接測定包封薏苡仁油的量。要準確定量薏苡仁油的量，須從薏苡仁油脂質體破壁后的混合物中將磷脂和膽固醇完全除去，然后在235nm處測定吸光度。

2.2 破乳劑種類的選擇

包封率的測定須用破乳劑破壞脂質體包囊雙層膜，破乳效果完全才能使芯材完全從包囊的脂質體中轉移到測定溶媒中，選擇破乳劑種類在包封率測定中至關重要。

乙醇、甲醇和Triton X-100對薏苡仁油脂質體的破乳效果如表1所示。

表1 不同種類破乳劑破乳后吸光度Table 1 Absorbance of coix seed oil with different demulsifies

破乳后從表觀現象看，乙醇、甲醇、Triton X-100的加入都能將脂質體壁材卵磷脂溶解，乳液包埋形成的脂質體界面消失，破乳效果良好。從本質來說，破乳效果越好，包封薏苡仁油轉移到測定溶媒中越多，吸光值越大。由表1可知，3種破乳劑破乳效果為：甲醇＞Triton X-100＞乙醇，由于加入的總薏苡仁油量相同，比較破乳后所得薏苡仁油量，可以看出3種破乳劑的破乳效果相差不是很大?？紤]溶劑毒性與成本，實驗宜選用乙醇為破乳劑。

2.3 超聲破壁時間的考察

不同超聲破壁時間的吸光度見表2。

表2 不同超聲破壁時間的吸光度Table 2 Absorbance of coix seed oil with different ultrasonic time

脂質體包封被破壁效果越好，乳化破壞程度也越高，因此吸光值越大。由表2可知，超聲破壁時間對脂質體包封率的影響較大，當破壁時間超過30min時，能夠完全將脂質體中的薏苡仁油釋放到石油醚中；30min超聲處理可以達到脂質體破壁最大化，達到分離薏苡仁油的最佳效果。

2.4 薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇的溶解特性及薏苡仁油的分離

薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇在石油醚、冷乙醇及熱乙醇中的溶解性效果見表3。

表3 薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇的溶解性Table 3 Solubility of coix seed oil，lecithin and cholesterol

由表3可知，薏苡仁油易溶于石油醚，微溶于熱乙醇，不溶于冷乙醇；而卵磷脂和膽固醇都易溶于熱乙醇；乙醇與水可以任意比例互溶，而石油醚不溶于水[13]。當破乳脂質體溶解在石油醚和冷乙醇水混合體系，靜置后會分為兩層，薏苡仁油溶解于上層石油醚體系，磷脂和膽固醇溶解于下層乙醇與水層。該方法可以將破乳脂質體的磷脂、膽固醇和薏苡仁油分開，達到高效分離薏苡仁油的目的。

2.5 包封率的測定

根據紫外掃描圖譜選取235nm為檢測波長，在該條件下測定不同濃度薏苡仁油標準溶液的吸光度，根據實驗結果繪制標準曲線，結果如圖2所示。薏苡仁油在0～13μg/mL范圍內，吸光度與濃度成良好的線性關系，線性回歸方程為：A=715.2C+0.0071，相關系數R2=0.9981。

透析時間對脂質體包封率的影響見圖3。透析16h以前的脂質體中游離薏苡仁油不能完全除去，導致所測的包封率偏高；透析時間16h時，游離薏苡仁油幾乎完全除去；故選取透析時間為16h。

圖2 薏苡仁油石油醚標準曲線Fig.2 Standard curve of coix seed oil in petroleum ether

圖3 透析時間對包封率的影響Fig.3 Effect of dialysis time on the entrapment efficiency

2.6 分離法精密度考察

精密度考察實驗三次測得吸光度分別為：0.338、0.347、0.350，平均吸光度為0.345，RSD為1.81%，證明脂質體中包封薏苡仁油的破壁分離精密度較好，具有實際應用的可行性。

2.7 回收率實驗

加樣回收率結果如表5所示，平均回收率98.68%，RSD=1.98%，表明該法可行。

表4 加樣回收率測定結果Table 4 Method recovery of coix seed oil

3 結論

采用透析法分離包封與未包封薏苡仁油，對薏苡仁油脂質體有良好的分離效果，脂質體與游離薏苡仁油分離完全，分離法精密度RSD=1.81%，加樣回收率98.68%，RSD=1.98%。實驗結果表明，建立的測定方法操作簡單，結果準確，適用于薏苡仁油脂質體包封率的測定。

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