竹葉多糖的組分及抗氧化活性分析

殷 軍，葛 青，毛建衛，*，方 晟

（1.浙江理工大學理學院，浙江杭州 310018；2.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江杭州310023；3.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州310023；4.紹興文理學院元培學院，生命科學系，浙江紹興 312000）

近年來，人們圍繞竹類主要化學成分的分析及其開發利用開展了大量的研究工作。研究表明，竹葉中含有黃酮及其苷類、活性多糖類、特種氨基酸及其衍生物、葉綠素及一些具有揮發性成分的化合物。竹葉提取物不僅具有良好的防腐性能和抗氧化性能，而且還具有醫療、生理保健功能，是一種十分理想的天然綠色食品及化妝品添加劑[1]。竹葉中的多糖是除黃酮之外的另一種重要的生理活性物質[2]，國內對竹葉多糖的提取優化研究比較多，但對竹葉多糖的組分及抗氧化活性研究比較少。研究對竹葉多糖的組分及抗氧化活性進行了研究，旨為竹葉多糖的進一步研究利用奠定基礎，同時為竹葉資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛竹葉 采自浙江科技學院后山，60℃烘干，粉碎備用；試劑 二苯基苦基苯肼（DPPH）、氮藍四唑（NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、鐵氰化鉀、三氟乙酸；透析袋；單糖標準品 鼠李糖、木糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、D-葡萄糖醛酸 均為Sigma公司產品；其余試劑 均為國產分析純。

精密電子天平 上海第二分析儀器廠；FD-1冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司；100B數顯定時蠕動泵 上海荀甫滬西儀器廠；紫外可見分光光度計 日本日立公司；800B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠制；DEAE Sepharose FF、Sephcryl S-100 GE healthcare Bio-Sciences AB。

1.2 實驗方法

1.2.1 竹葉多糖的提取及純化[3]將預處理好的竹葉置于大燒杯中，加入1∶30的蒸餾水煮沸2h，然后減壓濃縮。提取液中加入3倍體積的無水乙醇，搖勻后放置冰箱24h，在4000r/min下離心10min，取沉淀。沉淀溶于水，用Sevag法脫蛋白后，加入無水乙醇至濃度30%，搖勻后放置冰箱24h，離心取沉淀，冷凍干燥得粗多糖BLP30。

取粗多糖BLP30溶于蒸餾水中，配制成20mg/mL的溶液，5000r/min離心15min，取上清液用DEAESepharose Fast Flow離子柱層析（2.6cm×40cm）進行初步分離，上樣量為20mL。首先以蒸餾水洗脫，再用0.1、0.2、0.4、0.6、2mol/L的NaCl進行梯度洗脫，自動部分收集儀分步收集流分，洗脫液每10mL收集一管，苯酚-硫酸法檢測，根據糖顯色反應結果合并相同流分。將0.1mol/L NaCl洗脫液，濃縮、反復透析，冷凍干燥得BLP30。

采用AKTA explorer層析系統，Sephacryl S-100凝膠柱層析對樣品進行純化。洗脫條件：凝膠柱Sephacryl S-100（2cm×55cm）；洗脫液：蒸餾水；流速：1mL/min；樣品濃度：10mg/mL，上樣體積1mL；洗脫液以5mL/管收集，苯酚-硫酸法檢測，以吸光度對洗脫體積作圖。

1.2.2 分子量的測定 分子量的測定采用尺寸排除色譜和激光光散射聯用儀（SEC-LLS）。泵的型號為：Waters-1515（Waters China.Ltd.，USA），柱子型號為：ultrahydrogel250（7.8mm×300mm）和ultrahydrogel 1000（7.8mm×300mm），柱溫45℃，檢測器為八角度激光光散射儀（λ=658nm；HELEOS 8，Wyatt Technology Co.，USA）和示差檢測器（RI-2414），流動相為PBS（0.01mol/L，pH7.4），流量為1.0mL/min。檢測樣品濃度為3.0mg/mL。樣品檢測前經孔徑為0.2μm過濾器（Whatman，England）過濾。數據處理軟件為ASTRA（Wyatt Technologies）。

1.2.3 單糖組成測定

1.2.3.1 標準單糖的乙?；痆4-5]精密稱取等摩爾（2mmol/L）的巖藻糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖，分別溶于3mL蒸餾水中，加入20～30mg硼氫化鈉，于室溫下，間歇振蕩，還原3h，然后用冰醋酸中和過量的硼氫化鈉，至溶液不再產生氣泡為止，pH應在4～5之間，加入3mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復3～4次，以除去反應副產物硼酸及水分，然后置于真空干燥器中過夜。次日，110℃烘箱中加熱20min，充分除去殘留的水分后，加入4mL醋酐，100℃反應1.5h，冷卻，然后加入3mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復3～4次，以除去多余的醋酐。將乙?；蟮漠a物用4mL氯仿溶解后轉移至分液漏斗，加入少量蒸餾水充分振蕩后，除去上層水溶液，如此重復4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥，定容至10mL待GC分析。

1.2.3.2 樣品的乙?；幚?取2mg多糖樣品，放入旋轉蒸發瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸（TFA）4mL，在110℃封管水解2h。將水解液低于40℃減壓蒸干，然后加入3mL甲醇蒸干，重復上述操作4～5次，以完全除去TFA。然后按照1.2.3.1的方法進行還原、乙?；?，用氯仿定容至5mL，待GC分析。

1.2.3.3 氣相條件 氣相色譜儀配備HP-5石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm，5%phenyl methylsiloxane），氫火焰離子化檢測器（FID），高純氮作載氣，柱流量1mL/min。程序升溫：柱初溫120℃，以10℃/min升至240℃，保持6.5min。進樣量為0.1μL，分流比1∶30，進樣口和檢測器溫度均為250℃。氫氣35mL/min，空氣350mL/min，尾吹氣30mL/min。

1.2.4 抗氧化活性

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性測定 根據Espin等[6]的方法進行改進，測試了樣品對DPPH自由基清除活性。

改進后方法如下：在4mL濃度為100μmol/L的DPPH甲醇溶液中，加入2mL不同濃度的樣品，徹底搖勻后于室溫下暗處放置1h之后，采用可見光分光光度計于517nm下測定吸光度。以蒸餾水作為空白對照組，維生素C為陽性對照組。樣品的DPPH自由基清除活性（%）的計算公式為：

1.2.4.2 羥基自由基的清除活性測定 根據Cumbes and Smironoff[7]的方法改進，在1mL不同濃度的樣品中，分別加入1mL硫酸亞鐵（1.5mmol/L），0.7mL過氧化氫，0.3mL水楊酸鈉（20mmol/L）?；靹蚝?，在37℃水浴1h，采用可見分光光度在562nm下測定吸光度。以蒸餾水作為空白對照組，維生素C為陽性對照組。樣品的羥基自由基的清除活性計算公式為：

1.2.4.3 超氧自由基的清除活性測定 根據Liu and Ng等[8]的方法，進行了改進。將1mL不同濃度的樣品溶液中按順序加入1mL的氮藍四唑（NBT，300μmol/L），1mL的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，936μmol/L），最后加入1mL吩嗪硫酸甲酯（PBS，120mmol/L）啟動反應。以上溶液均用磷酸緩沖液（100mmol/L，pH7.40）配制。將該混合液混合均勻于室溫下放置5min后，采用可見光分光光度計于560nm下測定吸光度。以蒸餾水作為空白對照組，維生素C為陽性對照組。樣品的超氧陰離子自由基清除活性（%）的計算公式為：

2 結果與討論

2.1 竹葉多糖的洗脫曲線及分子量大小

圖1 竹葉多糖的Sephcryl S-100洗脫曲線Fig.1 Bamboo-Leaf polysaccharide Sephcry S-100 elution curve

竹葉多糖BLP30經Sephcryl S-100純化，共收集到2個主要多糖組分BLP30-1和BLP30-2。如圖1所示，通過SEC-LLS測定了BLP30-1和BLP30-2分子量（Mw）分別為2.9×104、2.1×104u。

2.2 單糖組成

經GC測定，由圖2～圖4可知，BLP30-1和BLP30-2都是由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖五種糖組成的。面積歸一化，BLP30-1的各單糖峰面積百分比分別為18.00%、25.65%、13.45%、25.99%、16.91%，其中木糖和葡萄糖含量最高。BLP30-2的各單峰面積百分比分別為25.40%、20.63%、17.25%、11.32%、25.40%，巖藻糖和半乳糖含量最高。

圖2 標準糖樣中單糖的氣相色譜Fig.2 Gas chromatogram of the monosaccharides in standard sample

圖3 樣品BLP30-1的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of the monosaccharides in BLP30-1

圖4 樣品BLP30-2的氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of the monosaccharides in BLP30-2

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性 研究表明，自由基與機體的許多功能障礙和疾病的發生有關。因此，研究自由基的檢測方法并探討物質對自由基的清除作用具有重要意義。DPPH（二苯代苦味酰自由基）分析法被廣泛用于清除自由基物質性質的研究，DPPH在有機溶劑中是一種穩定的自由基，其在517nm附近有強吸收（呈深紫色）。當自由基清除劑存在時，DPPH的孤對電子被配對，其517nm吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱的程度，可評價自由基清除劑的活性[9]。由圖5可以看出，隨著竹葉多糖濃度的增加，對DPPH清除的清除率呈上升趨勢。比較而言，BLP30-1具有更強的清除DPPH能力，但都弱于VC。BLP30-1、BLP30-2的IC50值分別為0.14、0.32mg/mL。

圖5 DPPH的清除活性Fig.5 Scavenging effects of the samples on DPPH radical

2.3.2 羥基自由基清除活性 羥基自由基是最活躍的自由基，可以輕易穿透細胞膜。羥基自由基會與重要的生物分子反應包括碳水化合物、蛋白質、脂質、DNA，導致組織損傷或細胞死，因此清除羥基自由基對保護生物系統是非常重要的[10-11]。由圖6可以看出，兩種多糖對羥基都有較好的清除活性，而且最終清除率都高于70%。當濃度在1.6mg/mL時，BLP30-1清除率達到80%以上。維生素C濃度在0.8～1.6mg/mL時，清除活性均在90%以上。對羥基自由基而講，目前普遍有兩個機理：a.抑制羥基自由基的產生；b.清除羥基自由，本實驗具體是哪種機理需要深入研究[12]。

圖6 羥基自由基的清除活性Fig.6 Scavenging effects of the samples hydroxyl radical

2.3.3 超氧自由基清除活性 超氧自由基是活性氧的一種，在體內由過氧化物歧化酶清除，如果體內過氧化物歧化酶活力下降或超氧產生過量都會對機體造成危害[13]。本實驗結果顯示，竹葉多糖對羥基自由基的清除作用與多糖的劑量呈一定的量效關系，當多糖的濃度為1.0mg/mL時，可以顯著抑制超氧自由基的產生（見圖7）。由圖7可知，維生素C抑制超氧自由基的效果并不理想。

3 結論

圖7 超氧自由基的清除活性Fig.7 Scavenging effects of the samples on superoxide radical

竹葉多糖經DEAE Sepharose F F和Sephcryl S-100純化后得到兩個主要多糖組分BLP30-1和BLP30-2。對二者的單糖組成、分子質量（Mw）測定表明，二者都有巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖五種糖組成，且分子量分別為分別為2.9×104、2.1×104u。對竹葉多糖進行抗氧化活性研究表明，其在清除DPPH、羥基自由基、超氧自由基有較高的功效。因此，竹葉多糖用于保健食品或藥品開發具有一定的價值，是一種優良的天然活性物質。

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