復合熒光RT-PCR技術檢測TBX2和p53在甲狀腺癌表達及臨床診斷意義

陳輝王云云劉艷

(1.廣州軍區武漢療養院，430074；2.華中科技大學同濟醫學院，430030)

復合熒光RT-PCR技術檢測TBX2和p53在甲狀腺癌表達及臨床診斷意義

陳輝1王云云2劉艷2

(1.廣州軍區武漢療養院，430074；2.華中科技大學同濟醫學院，430030)

目的 探討TBX 2、p53在正常甲狀腺組織、甲狀腺癌組織中的表達及臨床診斷意義。方法 采用復合熒光RT-P CR技術檢測45例甲狀腺癌組織和10例正常甲狀腺組織中TBX 2、p53基因mRN A的表達。結果 不同病理學類型甲狀腺癌TBX 2基因mRN A表達峰高與β-actin基因mRN A表達峰高之比在(1.283 2±0.354 5)～(2.37±0.488 9)，較正常甲狀腺明顯高(P＜0.01)；不同分化程度甲狀腺癌TBX2基因、β-actin基因mRN A表達平均峰高比值較正常甲狀腺明顯高(P＜0.01)。不同病理學類型甲狀腺癌p53基因mRN A表達峰高與β-actin基因mRN A表達峰高之比在(1.196 4±0.326 7)～(2.838 6±0.467 9)，較正常甲狀腺明顯高(P＜0.01)；不同分化程度甲狀腺癌p53基因、β-actin基因mRN A表達平均峰高比值較正常甲狀腺明顯高(P＜0.01)。結論 聯合檢測TBX 2和基因mRN A表達可為甲狀腺癌的早期診斷、預后判斷提供有價值的指標。

甲狀腺癌；RT-P CR；mRN A；TBX 2；p53

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，居頭頸部惡性腫瘤之首，也是近年來發病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。T-box蛋白質2(TBX2)是T-BOX基因家族成員之一，屬于發育調控相關轉錄因子基因，其在組織中表達上調，可作為腫瘤標志物。p53基因是人類腫瘤中突變率最高的抑癌基因，其突變型p53能引起細胞增生失控導致腫瘤發生。二者的表達異常均可作為甲狀腺癌早期診斷的參考依據之一。

為進一步探討TBX2和p53異常表達在甲狀腺癌臨床診斷中的作用，本文采用復合熒光RT-PCR技術，同時檢測TBX2和p53基因的表達，并對其相關性進行分析。

1 資料與方法

1.1 資料來源 回顧性收集某醫院2011—2012年接受甲狀腺癌手術切除甲狀腺組織45例，正常甲狀腺組織10例，組織均保存于－80℃冰箱中。甲狀腺癌及甲狀腺正常組織均經病理學診斷確診。其中甲狀腺腺瘤9例，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)15例，甲狀腺濾泡癌(FTC)12例，甲狀腺髓樣癌(MTC)8例，甲狀腺未分化癌(UTC)1例；按分化程度分化程度高11例，分化程度中12例，分化程度低22例。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA提取 取甲狀腺組織1 g，用組織勻漿后提取，采用TRIzol快速法提取組織mRNA[2]。

1.2.2 引物設計 應用Primer Premier5引物設計軟件設計特異性引物[1，3-4](表1)。

表1 引物設計

1.2.3 一步法RT-PCR擴增法的建立 采用一步法逆轉錄及PCR反應，反應體系10μL。內含RNA模板4μL，2×反應Buffer 1μL(內含有dNTP)，50 mM Mg2+0.45μL；p53濃度為0.4μmol/L，TBX2濃度為0.3μmol/L；β-actin濃度為0.15μmol/L；RT/Platinum Taq混合酶0.2μL，加Rnase-free的Milli-Q超純水補足至10μL。PCR擴增條件：50℃×45 min×1 cycle；95℃×2 min×1 cycle，95℃×1 min，58℃×1 min，72℃×2 min，共30 cycles；72℃×10 min。然后4℃保存。

1.2.4 確定mRNA轉化的PCR產物 應用ABI 310型DNA測序儀上的Genescan analysis 2.1 version軟件，通過與ROX-500標準分子量大小比對，確定TBX2、p53、β-actin基因mRNA轉化的PCR產物，并記錄測出每個特異性峰的峰高和峰面積。

1.3 統計分析 應用t檢驗，比較甲狀腺癌和正常組織TBX2、p53、β-actin基因mRNA表達的差異與變化[5]。

2 結果

2.1 甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織TBX2基因mRNA表達峰高的差異 運用多重復合熒光RT-PCR技術，以及ABI 310型DNA測序儀上的Genescan analysis 2.1 version軟件對甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織進行檢測，記錄甲狀腺腺瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌、正常甲狀腺組織進行TBX2基因mRNA表達峰高與β-actin基因mRNA表達峰高之比(表2)。與正常甲狀腺組織相比，不同組織分類甲狀腺癌組織TBX2基因、β-actin基因mRNA表達峰高比值差異有顯著性。

不同分化程度甲狀腺癌TBX2基因、β-actin基因mRNA表達平均峰高比值(表3)與正常甲狀腺組織相比，不同病理分化程度甲狀腺癌組織TBX2基因、β-actin基因mRNA表達峰高比值差異有顯著性。

2.2 甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織p53基因mRNA表達峰高的差異 運用多重復合熒光RT-PCR技術，以及ABI 310型DNA測序儀上的Genescan analysis 2.1 version軟件對甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織進行檢測，記錄甲狀腺腺瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌、正常甲狀腺組織進行p53基因mRNA表達峰高與β-actin基因mRNA表達峰高之比(表4)。與正常甲狀腺組織相比，不同組織分類甲狀腺癌組織p53基因、β-actin基因mRNA表達峰高比值差異有顯著性。

不同分化程度甲狀腺癌p53基因、β-actin基因mRNA表達平均峰高比值結果(表5)與正常甲狀腺組織相比，不同病理分化程度甲狀腺癌組織p53基因、β-actin基因mRNA表達峰高比值差異有顯著性。

表2 甲狀腺癌組織TBX2基因、β-actin基因mRNA表達平均峰高比值

表3 不同分化程度甲狀腺癌TBX2基因、β-actin基因mRNA表達平均峰高比值

表4 甲狀腺癌組織p53基因、β-actin基因mRNA表達平均峰高比值

表5 不同分化程度甲狀腺癌p53基因、β-actin基因m RNA表達平均峰高比值

3 討論

TBX2基因位于17號染色體長臂2區3帶(17q23)，是T-BOX基因家族成員之一，屬于發育調控相關轉錄因子基因，通過其特有的TBOX區域參與多種生物的發育調控，其編碼蛋白TBX2主要通過功能域發揮轉錄抑制作用。研究發現，TBX2在乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中高表達，并且與細胞惡性轉化、腫瘤細胞增生以及細胞凋亡等有關，促進腫瘤發生、發展[6]。本研究發現，TBX2 mRNA在甲狀腺腺瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌組織中表達的陽性率分別為1.196 4±0.326 7、1.587 9±0.378 7、2.373 2±0.357 4、2.564 7±0.486 9、2.838 6±0.467 9，與正常甲狀腺組織相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。在不同分化程度的甲狀腺癌組織中，與正常甲狀腺組織相比較，差異有高度統計學意義(P＜0.01)，提示TBX2 mRNA在甲狀腺癌組織中的表達有一定的特異性，且與甲狀腺癌組織的分化程度及組織學分型有關：甲狀腺癌組織分化程度越低，惡性程度越高，TBX2 mRNA表達越強。同樣，不同分化程度的甲狀腺癌組織，與乳頭狀癌、濾泡癌及髓樣癌組織相比較，TBX2表達差異也有顯著性，上述結果提示TBX2參與了甲狀腺癌的發生發展過程，但其具體作用機制有待進一步研究。

p53基因是迄今為止發現的與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因。該基因定位于人類染色體17q13.1，全長約20 kb，編碼一個分子量為53 KDa的磷酸化蛋白。野生型p53蛋白可通過修復損傷的DNA等抑制腫瘤的生長，突變型則誘發機體免疫機制，產生針對p53的免疫抑制，逃避免疫監視，促進腫瘤的生長。人類許多腫瘤中均有不同程度的p53基因突變，在乳腺癌、肺癌、大腸癌、胃癌等腫瘤中突變型p53通常高水平表達[7]。本研究發現p53在正常甲狀腺組織未見表達，而在不同組織類型、不同分化的甲狀腺癌組織均有表達，且低分化程度越低，甲狀腺癌組織中的p53表達越高；不同組織類型中，也表現出一定的差異性，甲狀腺髓樣癌組織中p53表達高于甲狀腺濾泡癌及乳頭狀癌組織，差異有顯著性。提示p53同樣也參與了甲狀腺癌的發生發展過程，其表達與甲狀腺癌分化差、惡性程度高、預后差有密切關聯，可將其作為臨床診斷、治療的觀察指標之一。對于TBX2、p53在參與了甲狀腺癌的發生、發展中的機制，推測認為：有一定的協同作用，TBX2、p53在甲狀腺癌組織中高表達可能是甲狀腺癌惡性程度高、增生迅速的原因之一，具體作用機制有待進一步研究。

在檢測手段方面，本研究應用熒光標記及多重半定量RT-PCR技術研究TBX2、p53基因表達，選擇的TBX2、p53基因產物長度分別為211 bp、194 bp相差不大，產物間可能重疊，可在TBX2、p53兩基因正鏈的5’端分別掛上6-FAM(蘭色標記)、HEX(綠色標記)；由于管家基因β-actin產物為353 bp，與TBX2、p53兩基因表達產物片段長度差異較大。因此，在β-actin基因的正鏈的5’端分別掛上6-FAM(蘭色標記)。將TBX2、p53基因及管家基因β-actin基因放在同一EP管中進行同時、同步RT-PCR擴增，其RT-PCR擴增片段長度相近的產物可以通過片段峰的顏色加以區分。所以，應用熒光標記可以實現多重RT-PCR。

對產物的定量分析，常規RT-PCR半定量研究多常用瓊脂糖凝膠電泳、圖像掃描分析技術，對RT-PCR產物進行灰度間比較，其分析結果與電泳、攝影技術密切相關，有時甚至可影響科研結果。熒光標記的PCR產物可以準確測定各特異性基因的熒光峰高、峰面積，對各基因表達產物進行定量分析[8]。在進行RT-PCR半定量研究方面，熒光標記、多重復合RT-PCR、毛細管電泳及激光掃描技術有著巨大的優勢和應用前景。

[1]宋曉環，王曉林，孫冬梅，等.TBX2在甲狀腺癌組織中的表達及其臨床意義[J].中國免疫學雜志，2012，28(9)：840-842.

[2]黃代新，吳梅筠，張林，等.大鼠液壓沖擊腦損傷bFGF及其受體FGFR1 mRNA表達[J].中國法醫學雜志，2003，18(3)：131-134.

[3]吳新剛，彭姝彬，閭四平，等.p53對乳腺癌耐藥蛋白基因的轉錄調控[J].中國生物化學與分子生物學報，2012，28(2)：152-157.

[4]SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR[OL].http：//tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/superscript-Ⅲfirststrand_pps.pdf.

[5]賀佳，尹平.醫學統計學[M].北京：高等教育出版社，2012：85-101.

[6]Teng H，Parker MI，Prince S.Functional characterization of cis-acting elements involved in basal transcription of the human Tbx2 gene：a new insight into the role of Sp1 in transcriptional regulation[J].Gene，2008，423(1)：8-13.

[7]Kitamura A，Yashima K，Okamoto E，et al.Reduced Fhit expression occurs in the early stage of esophageal tumorigenesis：no correlation with p53 expression and apoptosis[J].Oncology，2001，61(3)：205-211.

[8]Savory J，Rao JK，Huang Y，et al.Age-related hippocampal changes in Bcl-2：Bax ratio，oxidative stress，redox-activeiron and apoptosis associated with aluminum-induced neurodegeneration：increased susceptibility with aging[J].Neurotoxicology，1999，20(5)：805-817.

Objective To explore the expression and clinical significance of TBX2 and p53 in normal thyroid tissue and thyroid cancer.Methods Multiplex fluorescent RT-PCR was adopted to detect the expression of gene mRNA in TBX2 and p53 in 45 cases w ith thyroid cancer tissue and 10 cases with normal thyroid tissue.Results The ratio of TBX2 mRNA expression peak height toβ-actin mRNA expression peak height in different pathologic types of thyroid cancer ranged from(1.283 2±0.354 5)to(2.37±0.488 9)，and it was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01)；the average mRNA expression peak height of TBX2 gene and β-actin gene in different degree of thyroid cancer was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01).The ratio of p53 mRNA expression peak height toβ-actin mRNA expression peak height in different pathologic types of thyroid cancer ranged from(1.196 4±0.326 7)to(2.838 6±0.467 9)，and itwas significantly higher than normal thyroid(P＜0.01)；the average mRNA expression peak height of p53 gene and β-actin gene in different degree of thyroid cancer was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01).Conclusion Joint detection of the expression of gene mRNA in TBX2 and p53 can provide valuable indicators for early diagnosis and prognosis of thyroid cancer.

Thyroid cancer；RT-PCR；mRNA；TBX2；p53

1005-619X(2013)09-0777-03

劉艷

2013-07-05)