豬支氣管敗血波氏桿菌的鑒定和生物學特性

馬有智，徐海圣，李雙茂

(1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058;2.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，浙江杭州 310021)

豬支氣管敗血波氏菌 (Bordetella bronchiseptica，Bb)能感染多種哺乳動物引起呼吸道隱性感染及急慢性炎癥［1］。Bb可以單獨或和其他病原菌協同致病，單獨感染豬可導致支氣管敗血波氏桿菌病，主要侵害仔豬［2］。Bb和產毒性多殺性巴氏桿菌混合感染則能導致嚴重的進行性萎縮性鼻炎，病豬發育遲緩，對飼料利用率降低，仔豬感染甚至出現死亡，給養豬業帶來嚴重的經濟損失。Bb易與支原體、副豬嗜血桿菌、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等感染，引起豬呼吸道綜合征，增加豬群病死率［3］。在所有分離的致病菌中，分離率排在豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、大腸埃希菌之后列第四［4］，是高熱綜合征細菌性病原的四大病原之一［5］。我們對從發病豬中分離到的細菌進行病原學研究，以期為預防和控制該病的流行提供依據。

1 材料與方法

1.1 細菌分離培養

取發病豬的肺、肝、脾、心血等組織，劃線接種于5%綿羊鮮血平板，37℃培養24 h，挑取單個菌落作純培養。用鮮血液平板、BHI培養基的18 h細菌培養物，分別作革蘭氏染色，觀察其形態和在固體及液體培養基中的培養特性。用微量生化發酵管 (購自杭州天和微生物公司)進行糖發酵及其他生化試驗，細菌為18 h培養物。

1.2 PCR鑒定

根據文獻［6］中的編碼Bb的flagellin的基因序列設計引物，PCR擴增后的DNA片段為237 bp。Pl:5’-CCCCGCACATTTCCGAACTTC-3’P2:5’-GGCTCCCAAGAGAGAAAGGCTT-3’，引物由上海生工合成，用ddH2O稀釋為10 μmol·L－1，－20℃保存備用。細菌DNA提取:用brain heart infusion(BHI)broth 2 mL接種細菌在37℃下培養20 h，取培養液1 mL 14 000 r·min－1離心30 s，棄上清液。沉淀物中加入滅菌蒸餾水，混勻100℃下煮沸5 min后迅速加入冰塊中，放置5 min，14 000 r·min－1離心2 min，取上清液作為模板DNA使用。PCR反應程序為94℃ 10 min，94℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 1 min，35個循環，72℃ 10 min。1%瓊脂糖電泳檢測。

1.3 藥物敏感性試驗

操作方法及結果判定參照文獻［7］進行。藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 小白鼠致病性試驗

分離株培養18 h后，傾注法平板計數，調整菌數約為1億mL－1，分別腹腔注射6只NIH小鼠(小鼠體重15～20 g·只－1，購自浙江大學實驗動物中心)。小鼠注射劑量為0.2 mL·只－1，觀察發病和致死情況，連續觀察6 d，剖檢死亡小鼠，無菌取其心血分離細菌并鑒定。

1.5 生物被膜 (Biofilm，BF)檢測

體外BF形成于測定方法參照文獻［8］的微孔板法進行適當改進，具體步驟如下:將細菌過夜培養液與新鮮BHI培養液按1∶3體積混勻后，取200 μL加入到96孔酶標板小孔中，37℃濕盒靜置培養24 h，棄去培養液，用0.85%的無菌生理鹽水250 μL洗滌2次以去除游離細菌，干燥后往各孔加入200 μL 0.1%結晶紫染色液，染色30 min后棄去染色液，0.85%的無菌生理鹽水250 μL洗滌3次，加入33%的乙酸溶液200 μL，待完全溶解后用酶標儀測定測其D570值。各試驗孔均設8個平行孔，以不含菌液的培養液為空白對照。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離培養

從發病豬的肺臟實質器官中共分離到4株細菌，分別命名為Bb5、Bb18、Bb49和Bb51。

2.2 分離菌株的形態培養特征和理化特性

分離菌株鏡下細菌分散排列，個別菌體呈兩極著色，均為革蘭氏陰性小桿菌。在綿羊血平板培養基上分離菌株形成表面光滑，濕潤，邊緣整齊的圓形菌落。4株菌中，Bb5在血平板上呈β溶血，其余3株菌均呈α溶血。在BHI培養基中呈均勻渾濁生長，Bb5菌株在培養液表面能形成明顯的生物被膜 (圖1)。4株細菌都不分解碳水化合物，觸酶和氧化酶都是陽性。

圖1 分離菌株在BHI培養基中形成的生物被膜

2.3 分離菌株的PCR檢測

結果 (圖2)顯示，4株分離菌均能擴增出預期大小的237 bp的DNA片段。PCR產物經克隆測序分別與波氏桿菌fla基因 (No.AF232939)序列100%同源性 (序列略)。

圖2 分離菌株的flagellin基因PCR產物

2.4 分離菌株的藥物藥敏性

分離菌對阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、先鋒必、氧呱嗪青霉素、環丙沙星、氟派酸、菌必治、氯霉素、慶大霉素等敏感，對新霉素、紅霉素、壯觀霉素、復方新諾明、四環素等不敏感;Bb51對林可霉素、復達欣和氨芐青霉素中度敏感，其他3株菌不敏感 (表1)。

2.5 分離菌株的動物致病性

分別接種Bb5、Bb18、Bb49和Bb51細菌，6只小白鼠中死亡數分別為5，0，6和1只，對照組無異常，顯示4株菌對小白鼠毒力有差異。取死亡鼠心血接種血平板，結果分離出純的經鑒定與接種菌一致的細菌，證明為豬支氣管敗血波氏桿菌并對小鼠有一定致病性。

表1 分離菌株對藥物的敏感性

2.6 分離菌株的生物被膜

4株菌形成生物被膜能力不同，差異分析結果(圖3)顯示，Bb5，Bb18，Bb49與Bb51之間有極顯著差異。

圖3 分離菌株的生物被膜形成

根據《伯杰細菌鑒定手冊》，對4株分離細菌從形態、培養特性、生理生化特征和PCR鑒定等，確定4株分離菌均為支氣管敗血波氏桿菌。在對該菌培養特性進行鑒定過程中，發現該菌具有較強的變異性，即易于由強毒力的Ⅰ相菌變異為弱毒力的Ⅱ、Ⅲ相菌，表現為初代分離物在血平板上培養可產生綠色色素，在普通瓊脂平板及普通肉湯中生長不產生色素，此特征為強毒力的I相菌的表現。藥

3 小結和討論

敏試驗結果顯示，4株菌對大多數抗生素的敏感性基本相同，只有Bb51對林可霉素、復達欣和氨芐青霉素中度敏感，而其他3株菌均不敏感。4株菌在液體培養時，只有Bb5能形成明顯的BF，其他3株菌BF不明顯。BF定量測定顯示，4株菌中，Bb5和Bb18生物被膜形成量最多，而Bb51形成量最少;而動物試驗顯示 Bb5和 Bb49毒力較強，Bb18和Bb51基本無毒力，說明毒力與BF的形成量沒有明顯的相關性，這與文獻報道有一定不同［9］。然而，我們發現從發病棘胸蛙分離的嗜水氣單胞菌，其BF與毒力之間具有正相關性，這可能與細菌的種類不同有關?？傊?，細菌毒力、BF形成能力與藥物敏感性三方面之間的關系還需要進一步的研究。需要注意的是，體外藥敏試驗沒有考慮BF的因素，在動物體內細菌以BF的形式黏附于呼吸道黏膜引起耐藥。因此，我們在臨床對支氣管敗血波氏桿菌引起的感染治療時，藥敏試驗結果只能作為參考依據。

［1］陸承平．獸醫微生物學［M］．3版．北京:中國農業出版社，2002:276－277.

［2］斯特勞．豬病學［M］．8版．北京:中國農業大學出版社，2000:369－396.

［3］袁翠霞，羅阿東，徐景峨，等．豬萎縮性鼻炎支氣管敗血波氏桿菌PCR檢測方法的建立［J］．中國預防獸醫學報，2007(11):896－899.

［4］Zhao Z Q，Wang C，Xue Y，et al．The occurrence of Bordetella bronchiseptica in pigs with clinical respiratory disease［J］．The Veterinary Journal，2011，188:337 －340.

［5］徐引弟，王治方，蔡旭旺，等．河南省規?；i場高熱綜合征細菌性病原的分離鑒定［J］．河南農業科學，2010(1):116－118.

［6］Hozbor D，Fouque F，Guiso N．Detection of Bordetella bronchiseptica by the polymerase chain reaction［J］．Res in Microbiol，1999，150(5):333 －341.

［7］Davies D．Understanding biofilm resistance to antibacterial agents［J］．Nat Rev Drug Discov，2003(2):114－122.

［8］Stepanovic S， Vukovic D， Dakic I， et al． Modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation ［J］．J Microbiol Meth，2000，40:175－179.

［9］Fux C A，Costerton J W，Stewart P S，et al．Survival strategies of infectious biofilms［J］．Trends Microbiol，2005，13:34－40.