阿卡波糖、二甲雙胍、吡格列酮對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織腫瘤壞死因子－α及細胞色素P4502E1的影響＊

于紅艷，張松筠，周曉映，魏 紅，康亞星，李京芳 ，魏東敏，劉 紅，張慶九

(1.河北工程大學附屬醫院，河北 邯鄲 056006; 2.河北醫科大學第二醫院，河北 石家莊 050000;3.河北省胸科醫院，河北 石家莊 050048; 4.河北省正定縣醫院，河北 石家莊 050800)

近年來，肥胖、高血脂、代謝綜合征、糖尿病患者越來越多，由此引發的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發病率日益增高，其發病機制尚未完全明確，但目前普遍認為胰島素抵抗參與該病的發生發展過程。阿卡波糖、二甲雙胍、吡格列酮可從不同途徑增加胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗。本研究中以高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，觀察細胞色素P450(CYP2E1)、腫瘤壞死因子 －α(TNF－α)在肝臟中的表達及阿卡波糖、二甲雙胍、吡格列酮對NAFLD的預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料

動物:雄性SD大鼠60只，清潔級，體重(180±10)g，購于河北醫科大學動物實驗中心，動物許可證號為SCXK(冀)2008－1－003。分籠喂養，動物房內通風良好，室溫保持在18～25℃，相對濕度40% ～60%，光照時間每天12 h。

藥物及試劑:阿卡波糖(50mg/片，拜耳醫藥保健有限公司，批號為BJ10507);鹽酸二甲雙胍片(500mg/片，上海施貴寶制藥公司，批號為1112103);鹽酸吡格列酮片(15mg/片，天津武田藥品有限公司，批號為110501)。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(北京柏定生物工程有限公司);堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(北京利德曼生化技術有限公司);血糖測定采用葡萄糖氧化酶法;胰島素放免試劑盒(北京福瑞生物工程公司);甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。CYP2E1多克隆抗體購于武漢博士德公司;兔抗TNF－α多克隆抗體購于北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

動物模型建立與分組:將大鼠隨機分為5組，每組10只。正常對照組(NC組)，普通飼料喂養12周;非酒精性脂肪肝組(NF組)，高脂飲食喂養12周，高脂飲食配料包括80.5%基礎飼料、2%高膽固醇、7%豬油、10%蛋黃粉及0.5%膽鹽;阿卡波糖干預組(AN組)，高脂飲食喂養同時加用阿卡波糖100mg/(kg·d)灌胃12周;二甲雙胍干預組(MN組)，高脂飲食喂養同時加用二甲雙胍500mg/(kg·d)灌胃12周;吡格列酮干預組(PN組)，高脂飲食喂養同時加用吡格列酮15mg/(kg·d)灌胃12周。

標本制備與保存:飼養12周，大鼠禁食12 h，麻醉后從下腔靜脈取血，分離血清，－70℃保存，以檢測血清學指標。迅速取出肝臟，稱重，切取數塊右葉肝組織保存于液氮內，以提取蛋白及總RNA，并取右葉肝組織固定于10%甲醛內，用于病理學檢查。

觀察指標與檢測方法:ALT，AST，ALP，TG，TC，FFA 及空腹血糖(FBG)均嚴格按照試劑說明書由自動生化儀進行測定，胰島素采用放射免疫法測定，計算胰島素抵抗指數(HOMA－IR=FBG×FINS/22.5)[1]。

組織病理學觀察:將取出的肝組織浸泡在10%甲醛溶液內固定，石蠟包埋，切片，行HE染色觀察肝細胞脂肪變性程度、炎性活動度及肝纖維化的程度，相關標準參照Dixon等[2]提出的肝細胞脂肪變分級方法及2000年全國肝病會議通過的肝纖維化分期方法[3]。

CYP2E1及TNF－α免疫組化檢測:免疫組化法依照試劑盒操作步驟進行。所有標本均在Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統內分析。

RT－qPCR:用Trizol試劑盒提取肝組織標本總RNA，在紫外分光光度儀上測定RNA樣品260 nm與280 nm波長處的吸光度(OD)值以計算RNA濃度，然后RNA用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。目的基因CYP2E1和TNF－α以及內參照β－actin的引物序列見表1，實時定量PCR在ABIPrism 7000上進行操作完成。根據實時熒光定量PCR中 C t值計算出ΔC t值。采用相對定量2－ΔΔC t法比較目的基因mRNA的表達差異，PCR中每個樣本均重復3次，取平均值。

表1 CYP2E1及TNF－αmRNA的引物序列及產物大小

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 血糖、肝功能及血脂

結果見表2。與正常對照組相比，非酒精性脂肪肝組中FINS及HOMA－IR均有明顯的上升趨勢(P＜0.05);與非酒精性脂肪肝組相比，3個干預組的FINS及HOMA－IR均明顯下降(P＜0.05)，其中二甲雙胍、吡格列酮兩組間無明顯差異(P＞0.05)，阿卡波糖組下降幅度不及二甲雙胍組和吡格列酮組(P＜0.05)。與正常對照組相比，非酒精性脂肪肝組ALT，AST，ALP活性以及TG，TC，FFA含量均明顯升高(P＜0.05);與非酒精性脂肪肝組相比，3個干預組ALT，AST，ALP活性以及 TG，TC，FFA 含量均明顯下降(P ＜0.05)，其中二甲雙胍、吡格列酮兩組間無顯著性差異(P＞0.05)，阿卡波糖組下降程度不及二甲雙胍、吡格列酮組(P＜0.05)。

表2 各組大鼠血糖、肝功能及血脂的比較(±s)

表2 各組大鼠血糖、肝功能及血脂的比較(±s)

注:與 NC 組相比，△P ＜0.05;與 NF組相比，▲P ＜0.05;與 MN 組相比，★P ＜0.05;與 PN 組相比，＊P ＜0.05。

血糖參數 肝功能血脂組別NC組NF組MN組PN組AN組FBG(mmol/L)6.02 ± 0.87 6.98 ± 0.48△5.92 ± 0.42▲5.46 ± 0.37▲6.20 ±0.33▲★＊FINS(mU/L)21.13 ± 3.98 27.51 ± 4.02△23.49 ± 3.12▲22.91 ± 2.36▲24.83 ±2.31▲★＊HOMA－IR 5.65 ± 1.24 8.53 ± 1.92△6.18 ± 1.31▲5.56 ± 0.98▲6.84 ± 1.03▲★＊ALT(U/L)52.56 ± 6.78 143.80 ± 76.34△79.86 ± 28.40▲84.73 ± 31.18▲76.43 ±26.54▲★＊AST(U/L)196.34 ± 12.97 358.76 ± 97.20△221.30 ± 34.21▲235.23 ± 33.62▲216.34 ±32.32▲★＊ALP(U/L)144.54 ± 23.48 207.47 ± 35.39△153.32 ± 44.20▲160.02 ± 45.32▲153.28 ±43.32▲★＊TG(mmol/L)2.70 ± 0.32 5.67 ± 0.54△3.96 ± 0.23▲3.60 ± 0.30▲3.87 ±0.26▲★＊TC(mmol/L)0.98 ± 0.25 2.76 ± 0.28△1.70 ± 0.34▲1.68 ± 0.26▲1.67 ±0.29▲★＊FFA(μmol/L)408.63 ± 31.80 584.40 ± 51.74△493.19 ± 38.89▲490.21 ± 43.67▲482.28 ± 37.68▲★＊

2.2 肝組織病理HE染色

正常對照組HE染色后可見正常肝小葉結構，未見肝細胞脂肪變性或壞死及炎性細胞浸潤;非酒精性脂肪肝組HE染色后可見肝小葉結構紊亂或消失，肝細胞腫大，出現中重度脂肪變性，肝小葉可見以單核細胞浸潤為主的炎癥反應;二甲雙胍干預組、吡格列酮干預組HE染色后亦可見肝小葉結構紊亂、肝細胞腫大及脂肪變性，兩組間無明顯差異，程度均輕于非酒精性脂肪肝組。阿卡波糖干預組肝小葉結構紊亂及脂肪變性程度雖輕于非酒精性脂肪肝組，但重于二甲雙胍干預組和吡格列酮干預組。見圖1。

2.3 TNF－α與CYP2E1m RNA及其蛋白表達

Real time PCR測定結果顯示:與正常對照組相比，非酒精性脂肪肝組TNF－α及CYP2E1mRNA表達量均明顯增多(P＜0.05);與非酒精性脂肪肝組相比，3個干預組TNF－α及CYP2E1m RNA表達量均明顯減少(P＜0.05)，其中二甲雙胍、吡格列酮兩組間無顯著差異(P＞0.05)，阿卡波糖組減少程度輕于二甲雙胍、吡格列酮組(P ＜0.05)，見圖 2。

圖1 各組大鼠肝臟HE染色改變(×400)

圖2 各組大鼠肝臟CYP2E1mRNA及TNF－αmRNA的變化

免疫組化染色法示:正常對照組TNF－α及CYP2E1陽性細胞極少;與正常對照組相比，非酒精性脂肪肝組TNF－α及CYP2E1陽性細胞顯著增加(P＜0.01)，棕黃色顆粒主要分布于中央靜脈周圍，與脂肪變一致;與非酒精性脂肪肝組相比，3個干預組TNF－α及CYP2E1陽性細胞顯著減少(P＜0.01)。與Real time PCR測定的mRNA結果相似，二甲雙胍、吡格列酮兩組間TNF－α及CYP2E1陽性細胞減少無顯著性差異(P＞0.05)，阿卡波糖組陽性細胞減少程度輕于二甲雙胍、吡格列酮組(P＜0.05)，見圖3和圖4。

圖3 各組大鼠肝臟TNF－α陽性細胞變化(×400)

圖4 各組大鼠肝臟CYP2E1陽性細胞變化(×400)

3 討論

目前，NAFLD發病機制尚未完全明確，但人們普遍接受Day等[4]提出的“二次打擊學說”:初次打擊為胰島素抵抗導致的肝臟脂肪沉積，肝細胞脂肪變性;第二次打擊為各種原因引起的氧化應激，使肝細胞膜發生脂質過氧化損傷，最終導致肝細胞壞死。

CYP2E1是細胞色素P450的2E1亞型，為微粒體混合功能氧化酶系中最重要的氧化酶，參與肝臟的代謝與解毒，高表達后可使肝細胞中氧化反應增強，造成肝細胞膜脂質過氧化，降低抗氧化系統的保護作用，損傷肝細胞[5]。研究發現，NAFLD肝細胞中CYP2E1表達增多，參與NAFLD的形成[6]。機體處于胰島素抵抗狀態時，胰島素將會失去對CYP2E1的抑制作用，使其含量增多，活性增強，導致氧化應激產物增多，激活肝臟星狀細胞，出現肝纖維化[7]。CYP2E1過度表達可導致氧化應激增強，減少糖原儲備，促進葡萄糖的合成，脂肪蓄積增多，減少肝臟中胰島素信號，增強胰島素抵抗，加重肝臟損傷[8]。因此，在NAFLD中，胰島素抵抗和CYP2E1是相互獨立又相互作用的兩個因素。

TNF－α為損害肝臟的重要因子之一。NAFLD患者血漿中TNF－α及其受體水平明顯升高，且肝組織中TNF－α及其受體mRNA表達水平升高[9]。TNF－α可激活細胞內JNK等信號通路，導致胰島素抵抗，而且有證據顯示，胰島素抵抗亦可促進TNF－α的產生，TNF－α可以促進肝臟脂肪酸的合成，增加血液中甘油三酯含量，刺激肝臟合成過多極低密度脂蛋白，參與肝臟纖維化的病理過程[10]。

阿卡波糖、二甲雙胍及吡格列酮可分別通過不同的作用機制改善胰島素敏感性，減輕胰島素抵抗。本研究中，以高脂飲食飼養大鼠，同時應用阿卡波糖、二甲雙胍及吡格列酮進行干預，結果顯示，與非酒精性脂肪肝組相比，阿卡波糖、二甲雙胍及吡格列酮干預組大鼠肝臟病理改變均減輕，血清 AST，ALT，ALP，TG，TC，FFA以及胰島素抵抗指數均較低，提示3種藥物對非酒精性脂肪肝均有預防作用。非酒精性脂肪肝組TNF－α及CYP2E1的表達水平明顯高于正常對照組，而3個干預組TNF－α及CYP2E1表達水平均有明顯的下降趨勢，提示阿卡波糖、二甲雙胍、吡格列酮對非酒精性脂肪肝的預防作用可能與其對TNF－α及CYP2E1的調節有關。但阿卡波糖對非酒精性脂肪肝的預防作用明顯弱于二甲雙胍、吡格列酮，可能與后兩種藥物對胰島素抵抗的改善作用更強有關。

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