研究G-四鏈體與其配體相互作用的技術方法概述

吉妍娟 陳興來 劉晶華

（浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310014）

0 前言

G-四鏈體是由富含鳥嘌呤（G）的DNA序列通過自身折疊形成的特殊DNA二級結構[1]。該結構通常存在于染色體端粒末端及重要原癌基因的啟動子區域，包括 c-myc、c-kit、bcl-2、kRAS，VEGF、胰島素基因等[2]。研究表明，某些基因的啟動子區域在形成G-四鏈體結構后，相應基因的轉錄和表達受到了影響；G-四鏈體的形成可能涉及到體內的一些重要生理過程，比如細胞凋亡、信號傳導和腫瘤發展等[3]。因此，G-四鏈體被認為是小分子抗腫瘤藥物研發中的新靶點[4]，而從分子水平考察小分子配體與G-四鏈體DNA作用的技術方法顯得尤為重要。目前，文獻報道中研究G-四鏈體與小分子配體之間相互作用的方法有十余種：紫外光譜、熒光光譜、圓二色譜、凝膠阻滯實驗、表面等離子體共振、熒光共振能量轉移、分子模擬、電噴霧電離質譜、核磁共振、X-射線衍射等。本文根據每種方法的研究目的進行分類闡述。

1 G-四鏈體結構鑒定技術

富含堿基G的DNA序列能夠在特定的離子強度和pH條件下，四條、兩條單鏈之間或一條單鏈內的G殘基通過Hoogsteen氫鍵形成G-四分體 (G-quartets)，如圖1所示。幾個G-四分體堆積到一起形成一種特殊的二級結構，即G-四鏈體(G-quadruplex)[5]。富含堿基G的DNA序列在不同的環境條件下主要形成三種典型的構型:平行，反平行和混合G-四鏈體DNA(圖2)。

圖1 四個鳥嘌呤通過Hoogsten氫鍵連接而成的G-四分體

1.1 圓二色譜

圓二色譜（CD）是目前最方便和最直接獲得DNA二級結構的技術，它被廣泛應用于研究G-四鏈體的結構變化。平行型G-四鏈體在265 nm附近有正的最大吸收，240 nm有負的最大吸收；反平行型G-四鏈體在295 nm附近有正最大的吸收，260 nm有負的最大吸收；混合式的G-四鏈體構型則包括了290 nm附近的正吸收以及特征的265 nm附近的肩峰[6]。Jyotirmayee等[7]對含有20個堿基的c-kit2 DNA序列形成的G-四鏈體DNA的特征CD譜圖分析表明，在K+溶液中DNA主要以平行式的G-四鏈體存在。

圖2 不同G-四鏈體結構

1.2 凝膠阻滯實驗

凝膠阻滯實驗（EMSA）方法近來被廣泛用于研究G-四鏈體DNA與小分子配體相互作用的檢測中。一般而言，分子量不同，分子緊密程度不同的DNA片段在同等電壓的作用下通過聚丙烯酰胺凝膠孔徑的速率是不同的[8]。因此，當DNA樣品與小分子配體作用后，誘導形成穩定的G-四鏈體結構時，樣品的電泳遷移率與陰性對照相比就會有變化。D Sun[9]等人利用聚丙烯凝膠電泳研究了寡聚核苷酸HTG21在無化合物存在下，幾乎以單體的形式存在，隨著化合物的加入，出現了分子間的G-四鏈體二聚體，當化合物濃度達到30 mM時，二聚體的條帶更加明顯，如圖3所示。

圖3 凝膠電泳分析化合物誘導寡聚核苷酸HTG21的作用

1.3 核磁共振波譜法(NMR法)

對大多數的寡聚核苷酸所形成的G-四鏈體拓撲結構都能夠運用NMR譜來進行研究，這種技術能提供關于四鏈體的構象和動力學行為的結構信息[10]。NMR研究利用譜圖中可交換質子的共振信號來分析DNA結構。從緩慢交換的鳥嘌呤亞胺氫的數量可推測DNA鏈的數量以及G-四分體的數量和四鏈體的對稱性。亞胺質子化學位移>12.5 ppm表示Watson-Crick堿基對存在(NH…N氫鍵)；亞胺質子化學位移在10.5-12 ppm表示鳥嘌呤的NH…O氫鍵的存在，即形成了G-四分體[11]。

1.4 X-ray晶體衍射分析法

作為唯一可以對結構進行研究的直接方法X-ray晶體衍射技術，在研究G-四鏈體的結構中扮演著一個重要角色。該方法能獲得G-四鏈體及G-四鏈體-配體復合物的精確并詳細的結構信息[12]。X-ray單晶衍射分析所得到的晶體結構非常明確，它能夠給出金屬離子的位置，小分子配體的結合位置，以及溝槽的水合作用情況。但是，有些晶體的結構并不一定是溶液中存在的最優、最主要的結構，因為晶格能和結晶條件會影響G-四鏈體結構。

2 研究配體與G-四鏈體結合力的實驗技術

在藥物研發過程中，針對靶G-四鏈體，為了提高藥物的專一性，發現特異性較強誘導G-四鏈體形成和使之穩定的配體成為研究者們追逐的目標。小分子與不同結構的G-四鏈體作用的親和力不同，對G-四鏈體和雙鏈DNA的選擇性親和能力也不同[13]。因此，研究它們的不同親和力的技術方法是非常重要的。

2.1 表面等離子共振技術

表面等離子體子共振(SPR)技術可以不用任何標記物來考查小分子化合物與DNA之間特異性的相互作用性質，包括它們的結合，解離速率以及它們的親和力等。該方法將待測的DNA通過共價結合方式固定到特定載體上，待測小分子化合物跟隨流動相注射流過固化DNA的表面，小分子不斷地與固定化的DNA結合，通過記錄載體表面的折射應答信號 (Ru)，可以給出出相關動力學參數（結合常數、解離常數）[14]。因此，可以利用SPR技術高通量篩選小分子化合物與目標G-四鏈體結合能力。

2.2 熒光共振能量轉移技術

熒光共振能量轉移(FRET)技術，將寡聚核苷酸的一端標記一個熒光供體 (FAM)，另一端標記了一個熒光受體，即熒光淬滅體 (如TAMRA)。方法原理如圖4所示，當無序的單鏈在K+存在條件下形成G-四鏈體后，熒光供體和受體之間的距離減小，引起供體激發能量轉移至受體，導致熒光淬滅。反之，當四鏈體結構熔解拆散，受體和供體距離增大，這時就重新產生很高的熒光信號[15]。因此，可利用這一技術能用于研究不同G-四鏈體結構的熱力學穩定性 (熔點)，以及評估不同小分子配體對四鏈體結構的穩定能力。Jyotirmayee等[16]利用FRET實驗，分析11種化合物對端粒、c-kit四鏈體以及對雙鏈DNA的選擇性識別能力和穩定能力。

圖4 熒光共振能量轉移技術原理圖

3 研究配體與G-四鏈體作用模式及計量關系的實驗技術

G-四鏈體DNA具有區別于雙鏈DNA的特殊幾何構造，導致小分子配體與G-四鏈體結合模式及結合位點的多樣化。研究表明，G-四鏈體DNA與小分子配體結合的位點包括G-四分體、溝槽(groove)、loop和離子通道；結合的模式主要包括：尾部堆積模式、內部嵌插模式和溝槽結合模式[17]（如圖5所示）。為了詳盡探究小分子與G-四鏈體的作用機制，有必要研發高效、實用及準確的考察配體與G-四鏈體作用模式的實驗技術。

圖5 小分子配體與G-四鏈體的結合模式

3.1 電噴霧質譜技術

電噴霧質譜(ESI-MS)憑借其快速、靈敏等特點被廣泛用于研究小分子配體與G-四鏈體的共價或非共價相互作用。ESI-MS已成功運用于DNA與配體作用的化學計量學研究中。Alessandro等[18]采用電噴霧質譜法分析得出化合物TAS2C與端粒四鏈體以及雙鏈DK66的結合比例分別為1:1和1:2，與c-kit序列結合的計量比為1:1。

3.2 紫外、熒光光譜技術

紫外可見吸收光譜（UV-Vis）是研究小分子與DNA相互作用的一種最簡便、最常用的技術。許多小分子化合物在紫外可見光區有吸收峰，當小分子與DNA發生相互作用時，會導致其吸收譜帶變寬、吸收峰紅移及減色效應。當小分子以嵌插方式結合在DNA堿基對之間時，紅移和減色效應要明顯大于溝槽結合和靜電結合作用[19]。熒光光譜法(FS)也是研究小分子化合物與G-四鏈體DNA相互作用的一種簡單技術手段。熒光物質的熒光強度會因為與DNA作用而發生變化，研究此變化過程可以獲取結合模式、結合常數、結合位點和分子間距等信息。小分子化合物嵌插到DNA的G-四分體之間中時，由于受到DNA堿基疏水環境的保護，自身的振動將受到抑制，熒光強度將出現一定程度的增強；靜電結合或溝槽結合則不會限制分子的自由旋轉，熒光強度沒有明顯變化[20]。

3.3 分子模擬技術

近年來，隨著計算機化學技術的發展、靶標DNA晶體結構的快速增長，分子模擬（Molecular modeling)已經成為虛擬篩選藥物分子，評價配體與受體結合能力和結合模式的一種重要方法。在研究小分子配體與G-四鏈體之間相互作用時，通?？梢允褂脙深愑嬎銠C分子模擬方法，即分子對接和分子動力學模擬[21]。分子對接是按照幾何互補、能量互補以及化學環境互補的原則來找到受體與配體之間的最佳結合模式。分子動力學是按照分子瞬時的運動狀態，把相互作用的兩個體系作為一個復合體系，模擬體系之間的非鍵相互作用和體系內部各個構象變化。Wei-Bin Wu等[22]利用分子模擬研究表明，化合物以表面堆垛的模式與G-四鏈體作用，側鏈伸入溝槽穩定四鏈體結構，且含有兩條側鏈的化合物與G-四鏈體的結合能力更強。

圖6 化合物與G-四鏈體相互作用的分子模擬

4 結語

本文綜述了研究G-四鏈體結構、小分子誘導并穩定G-四鏈體的能力、小分子與G-四鏈體作用模式的技術手段，為設計實驗方案研究小分子和G-四鏈體的作用，以及篩選靶向G-四鏈體的小分子提供了必要的技術支撐及有價值的參考。

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