新技術在魚類胚胎冷凍保存中的應用

沈 薔，章海敏，胡軍祥

(浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安 311300)

目前全世界魚類共有2.1 萬余種，在9 000 余種淡水魚類中，已有2%的種類滅絕;我國是一個水生生物資源豐富的國家，據統計大約有3 862種魚類，其中淡水魚類約有1 050種［1］，豐富的種質資源與遺傳多樣性為我國水產養殖業快速發展奠定了基礎。但是，近年來，魚類棲息環境污染、過度捕撈、水域面積縮減及外來入侵種的影響等，造成了某些魚類資源的衰退和瀕臨滅絕。已有92種淡水魚類被列為瀕危物種［2］。另外，養殖業的快速發展導致養殖魚類近親繁殖越加嚴重，不合理引種，種質退化，遺傳多樣性銳減，個體小型化，對環境和病害的防御能力下降，病害發生日趨嚴重，已造成巨大的經濟損失。因此，研究如何保護和利用好現有的水產種質資源和遺傳多樣性，實現我國水產養殖業的穩定和可持續發展是我國未來漁業科技發展的重點之一。

低溫保存是通過低溫抑制細胞代謝，使細胞由常溫下的高能耗、強代謝狀態，進入一種能量消耗、新陳代謝降至最低點的休眠狀態。生物體內的化學反應在溫度降低到-130℃時幾乎會完全停止。如果降溫方式合適，生物體系內部高度有序的結構狀態不被打亂，蛋白質、酶以及其他細胞結構均未被破壞，復溫后就能恢復活力［3］。根據這一原理，研究者對魚類配子和胚胎低溫保存進行了大量的探索，并已成功凍存了魚類精子，為解決魚類品種的異地異時雜交育種、珍稀魚類繁殖、物種遺傳物質的長期保存提供了可能性。在魚類卵子和胚胎玻璃化冷凍保存方面，由于魚類卵子具有體積大、雙層卵膜、透水性差、含有大量卵黃物質等特點，同時由于魚類生物學基礎研究的缺乏和低溫冷凍技術手段的局限性，盡管許多學者在冷凍保護劑毒性、細胞滲透性、降溫方法等各方面進行了大量的研究，取得了一定的成績，但目前仍未取得突破性的進展。本文綜述近年來幾種魚類胚胎低溫冷凍保存的成果、新技術及其研究進展。

1 魚卵及胚胎冷凍保存

近年來，魚類卵細胞和胚胎低溫和超低溫保存的研究引起人們的高度重視。盡管許多學者對魚類胚胎的冷凍損傷機理［4］、適宜冷凍的胚胎發育階段［5］、抗凍保護劑的種類和濃度［6］、冷凍降溫方法［7］和解凍復活技術［8］等進行了大量實驗研究，但目前尚未取得真正的突破?，F將近年來在魚類卵細胞和胚胎冷凍保存上取得的主要結果匯總于表1。

2 魚類胚胎超低溫冷凍

2.1 應用抗凍蛋白

一般抗凍劑對冷凍材料都有一定的毒性作用，且毒性隨抗凍劑濃度的提高而增加。因此尋求一種既能夠抑制冷凍溶液中冰晶形成，又不會對冷凍材料有毒性作用，或者毒性作用較小的新型抗凍劑非常必要。1969年，Devries 在南極Mcmurdo 海峽的一種Nototheneniid 魚血液中首先發現了抗凍蛋白，經研究發現，抗凍蛋白是一類具有熱滯效應、冰晶形態效應和重結晶抑制效應的蛋白質。迄今為止共發現5種抗凍蛋白，分別為抗凍糖蛋白(AFGPs)、Ⅰ型抗凍蛋白 (AFP Ⅰ)、Ⅱ型抗凍蛋白 (AFP Ⅱ)、Ⅲ型抗凍蛋白 (AFP Ⅲ)和Ⅳ型抗凍蛋白 (AFP Ⅳ)［16］。

表1 某些魚類卵細胞及胚胎冷凍的保存成活率

Robles 等［17］研究發現，向金頭鯛2 細胞期胚胎中顯微注射抗凍蛋白能顯著增加胚胎的低溫耐受能力。Martínez-Páramo 等［18］在冷凍斑馬魚胚胎時，在抗凍劑中添加了1 mL 的AFP I (10 mg·mL-1)，使胚胎的存活率從30% 提高到了55%。因此，將化學抗凍劑和抗凍蛋白混合使用，不僅降低了化學抗凍劑的使用濃度，減小了對胚胎的毒性，同時提高了魚類胚胎冷凍保存的存活率。

2.2 應用水通道蛋白

由于魚卵的雙層卵膜結構限制了水分和抗凍劑在膜兩邊的滲透，使抗凍劑難以滲透進入卵內，因此尋找一種改變膜通透性的方法至關重要。水通道蛋白 (aquaporin，AQPs)，最初由Agre 等于1988年偶然在紅細胞膜上發現，稱為形成通道的整合膜蛋白 (CHIP 28)，1991年，研究人員完成其cDNA克隆并進一步確定其為細胞膜上轉運水的特異性通道蛋白，并稱CHIP 28 為AQP 1。此后，陸續發現了水通道蛋白家族中的13個亞型 (AQP 0– AQP 12)。根據AQPs 的滲透特異性可將AQPs 分為2類:第1 類只對水有滲透性，如AQP 0-2、AQP 4-6、AQP 8 等;第2 類除轉運水之外，還對其他小分子溶質有滲透性，尤其是甘油，包括AQP 3、AQP 7、AQP 9-10 等［19］。

Delgado 等［20］將AQP 3 的cRNA 注射到未成熟的青鳉卵細胞中進行表達，經培養后發現水的滲透性接近未注射的正常卵細胞的2 倍，Gly、EG、PG和DMSO 的滲透性均明顯高于未注射的正常卵細胞，分別達到了 (2.20 ±1.29)×10-3，(2.98 ±0.36)×10-3，(3.93 ±1.70)×10-3，(3.11 ±0.74)×10-3cm·min-1，且經注射cRNA 后的未成熟卵細胞有51%發育成熟、發育成熟后有43%的卵細胞成功受精孵化。

2.3 顯微注射技術

魚類胚胎在冷凍保存過程中，內部的卵黃囊是魚類胚胎冷敏感性的關鍵部位。卵黃囊內含有水分，冷凍過程中會產生冰晶對胚胎造成損傷，但由于卵黃被卵黃合胞體層所包圍，卵黃合胞體層通透性差，阻礙了抗凍劑進入卵黃。因此有必要尋找一種方法來克服這一難點。

顯微注射法最初應用于基因工程，后來Liu等［21］利用這一技術對斑馬魚的6 體節期胚胎進行了部分卵黃 (50%～75%)去除，低溫冷凍后發現去除部分卵黃后，斑馬魚胚胎存活率及低溫耐受性均顯著提高。但是6 體節期胚胎在去除部分卵黃后出現了對部分冷凍保護劑 (如甲醇、丙二醇)的不滲透性?？梢娙コ糠致腰S對降低魚類胚胎冷凍的難度可能會具有一定的意義，但技術有待進一步突破。

Janik 等［22］率先將此方法應用到斑馬魚胚胎冷凍保存中，后來Beir?o 等［23］將顯微注射技術應用在金頭鯛的低溫冷凍中，并發現該技術可以對尾芽期胚胎使用更高濃度的冷凍保護劑，而不會對胚胎造成毒害，但是在改善胚胎冷敏感性方面并無顯著影響。武鵬飛等［24］研究了顯微注射抗凍劑種類、抗凍劑的注射劑量、注射濃度，以及抗凍劑注射后牙鲆胚胎的冷敏感性影響，發現抗凍劑毒性PVP ＞蔗糖，DMSO ＞MeOH ＞PG ＞PM (PG∶MeOH 體積比2 ∶1)，牙鲆胚胎較適宜的顯微注射劑量為750 pL，且顯微注射后胚胎的冷敏感性有一定的降低。

2.4 飛秒激光脈沖技術

顯微注射技術使用的納米針都是入侵式的，容易對胚胎內結構、相鄰細胞以及卵膜等造成破壞。隨著研究的深入，研究者發現飛秒激光技術可以有效地應用于生物學研究中。大多數細胞在近紅外波段是透明的，因此近紅外飛秒激光對細胞的穿透深度深，且當飛秒激光聚焦于透明材料時，聚焦處的光強非常高，足以引起非線性吸收，但聚焦處附近的熱影響非常小，對鄰近細胞幾乎沒有損壞。同時當激光束在膜上聚焦幾毫秒時，產生了瞬態的小孔，由于細胞膜具有流動性，損傷的細胞膜會在短時間內得到修復，從而再次形成完整的屏障［25］。

Kohli 等［26］在對狗腎細胞的研究中發現，利用飛秒激光脈沖技術對細胞進行穿孔不會造成細胞崩解、氣泡形成等細胞形態變化。同時將抗凍劑蔗糖通過瞬態小孔成功地滲透進狗腎細胞中［27］。之后又利用飛秒激光脈沖技術成功地將異硫氰酸熒光素、DNA (Simian-CMV-EGFP)等導入到斑馬魚的未去膜和去膜的胚胎中［28］。

2.5 超聲波空化

超聲波空化作用是指存在于液體中的微氣核(空化泡)在聲波的作用下振動，當聲壓達到一定值時發生的生長和崩潰的動力學過程?？栈饔靡话惆?個階段，空化泡的形成、長大和劇烈的崩潰。時蘭春等［29］指出穩態空化作用形成的空化泡可使其周圍的酶或細胞顆粒受到微聲流作用下的切應力作用，這可能導致細胞的破壞。但是低強度超聲波產生的穩態空化作用對細胞的破壞很小，主要是改變細胞膜的滲透性，促進可逆滲透，加強物質運輸，從而增加代謝活性和促進有益物質的生成。

Bart 等［30］認為超聲波空化在提高胚胎甲醇滲透性上是物理損傷最小的方法。Silakes 等［31］研究了超聲波對不同發育時期、不同去膜程度 (完全去膜、卵膜軟化、未去膜)斑馬魚胚胎的甲醇滲透性影響，發現超聲波處理能明顯提高胚胎的甲醇滲透性，且90%外包期最高達到了 (85.3 ±8.1)μmol，但是仍遠低于胚胎玻璃化所需濃度(10 mol·L-1)［32］。

3 展望

目前上述幾種新技術在魚類胚胎低溫保存中的應用還不夠廣泛，但已經引起了許多低溫工作者的濃厚興趣，并取得了一些研究成果。但是這些技術仍存在一些問題，如水通道蛋白和超聲波空化雖提高了胚胎對抗凍劑的滲透性，但仍遠未到達胚胎玻璃化的最佳濃度;顯微注射法容易對胚胎造成入侵式破壞;而飛秒激光技術還存在著價格高昂、儀器結構龐大、可操作性差等問題。相信隨著科學技術的不斷發展、各學科之間的相互交叉、各種新技術的不斷研發、各類技術的不斷結合，魚類胚胎冷凍保存技術必將不斷成熟與突破，其在水產養殖領域的前景一片光明。

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