微生物法測定維生素飲料中的維生素B12

陳亞波，周 敏，楊 彤

(中山市質量計量監督檢測所廣東省質量監督食品檢驗站(中山)，廣東中山 528403)

維生素B12又稱鈷胺素或氰鈷素，是由含鈷的卟啉類化合物組成的B 族維生素，深紅色針狀晶體，結構性質穩定。在中性溶液中耐熱，而酸、堿、日光、氧化劑和還原劑均能使其破壞。目前，維生素B12有多種檢測方法，包括微生物檢測法［1-4］、高效液相色譜法［5-7］、原子吸收分光光度法［8］、化學發光分析法［9］、酶聯免疫法［8］、液相色譜-質譜儀法［10］等。對于維生素飲料等功能性飲料，國家標準是采用高效液相色譜法，但由于儀器靈敏度不夠、干擾較大等原因，高效液相色譜法的應用受到很大的限制。微生物法則由于其高靈敏度及可靠性已得到國際上權威機構的廣泛認可。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

生化培養箱 (上海一恒);高壓滅菌器(Hirayama，日本);密封培養罐(北京路橋);pH計(奧立龍，美國);離心機(HETTICH，德國);紫外可見分光光度計(VARIAN，美國);旋渦混合器(IAK，德國)。

萊士曼氏乳酸桿菌(ATCC 7830，美國);維生素B12標準品(國家標準物質研究中心);MRS肉湯(北京路橋);哥倫比亞CNA 瓊脂(北京路橋);無菌脫纖維羊血(北京路橋);CO2產氣袋(三菱瓦斯，日本);乳酸桿菌瓊脂培養基(BD，美國);乳酸桿菌肉湯培養基(BD，美國);維生素B12測定用培養基(BD，美國)。

1.2 標準溶液的制備

1.2.1 維生素B12貯備液(10 μg·mL-1)

精確稱取維生素B12標準品10 mg，用25%乙醇定容至1 000 mL，儲存于冰箱內，保存期3個月。

1.2.2 維生素B12中間液(100 ng·mL-1)

用25%乙醇溶液將20 mL 維生素B12貯備液定容至200 mL，儲存于冰箱內，保存期3個月。

1.2.3 維生素B12工作液(1 ng·mL-1)

用25%乙醇溶液將2.0 mL 維生素B12中間液定容至200 mL，儲存于冰箱內，保存期3個月。

1.2.4 標準曲線工作液

分別吸取5 mL 維生素B12工作液于250 和500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，濃度分別為0.02，0.01 ng·mL-1，臨用前配制。

1.3 測試菌液的制備

1.3.1 萊士曼氏乳酸桿菌凍干菌株的活化

無菌條件下，將凍干菌株開封后，接種于MRS 肉湯中，35℃，正常環境培養48 h，然后接入含羊血的哥倫比亞CNA 培養基中，35℃下5%CO2環境培養48 h。

1.3.2 測試菌液制備

將活化后的萊士曼氏乳酸桿菌接種到乳酸桿菌瓊脂斜面上，(36 ±1)℃培養24 h，再轉接2～3代以增強活力。轉接到乳酸桿菌肉湯培養基中，(36 ±1)℃培養18～24 h 后，2 000 r·min-1離心3 min，棄上清液，加入10 mL 0.9%生理鹽水，混勻，再離心。如前操作，再清洗2 次，制成菌懸液。吸取適量該菌懸液于10 mL 0.9%生理鹽水中，混勻制成測試菌液。用紫外可見分光光度計，以0.9%生理鹽水做空白，在550 nm 波長下測定測試菌液的透光率，調節加入菌懸液的量，使測試菌液的透光率60%～80%。

1.4 樣品前處理

稱取1.3 g 無水磷酸氫二鈉，1.0 g 無水偏重亞硫酸鈉，1.2 g 檸檬酸(含1個結晶水)，用100 mL蒸餾水溶解。取適量樣品于三角瓶中，用10 mL 上述溶液混合，加150 mL 蒸餾水，用鋁箔紙封口，121℃水解10 min，冷卻后調pH 值至4.5±0.2，再用蒸餾水定容至250 mL，過濾。移取濾液5 mL，加入20～30 mL 蒸餾水，調pH 值至6.8 ±0.2，用蒸餾水定容至100 mL，為樣品處理液，備用。

1.5 標準曲線的制備

按表1 順序依次加入蒸餾水、標準曲線工作液和維生素B12測定用培養基于試管中，1 式3 份，反應體系均為10 mL。

表1 標準曲線的制備

1.6 待測液的制備

依次加蒸餾水、樣品處理液和維生素B12測定用培養基于試管內，1 式3 份，反應體系為10 mL(表2)。

表2 待測液的制備

1.7 滅菌及接種培養

將所有試管蓋上試管帽于121℃滅菌5 min。滅菌完畢，將試管取出后在冷水浴中迅速冷卻至30℃以下。用移液器向上述試管中各加50 μL 測試菌液，混勻，其中標準曲線管中S1除外。S1不接種菌液為不接種空白，S2接種菌液為接種空白。將所有試管放入生化培養箱內，(36 ±1)℃培養19～20 h。

1.8 測定方法

培養結束后，未接種空白試管S1內培養液應澄清，標準曲線管和試樣管中培養液的濁度應有梯度。以接種空白管S2作對照，在550 nm 波長下測定最高濃度管S10的吸光度，每隔2 h 進行測定。若2 次結果吸光度差值小于2 %，則取出全部試管測定吸光度。用未接種空白管S1作空白，調紫外可見分光光度計吸光度到0，讀出接種空白管S2的讀數。再以接種空白管S2為空白，調節吸光度為0，讀出其他每支試管的吸光度。

測定時，每支試管用渦旋混合器充分混合后，立即將培養液移入比色皿，讀出吸光度。以維生素B12標準品的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線。根據待測液的吸光度，從標準曲線中查得該待測液中維生素B12的濃度，再根據稀釋因子和樣品量計算出試樣中維生素B12的含量。

2 結果與分析

2.1 維生素B12的標準曲線

根據維生素B12標準系列管的吸光度平均值繪制標準曲線(圖1)。維生素B12含量在0.01～0.10 ng范圍線性關系良好。線性回歸方程為y=5.993 2x-0.056 8，相關系數R2=0.996 6。因此，可據此計算出樣品中維生素B12的含量。

2.2 方法的精密度

將3種不同品牌的維生素飲料各自取平行樣2份，測定維生素B12含量，按照國家標準方法要求，計算精密度(表3)，精密度均小于10 %，符合標準要求。

表3 精密度試驗結果

2.3 方法的重復性

對同一維生素飲料樣品按照本法進行10 次測定，進行重復性試驗(表4)。10 次測定的平均值為1.399 μg·L-1，相對標準偏差為0.738 0%。相對標準偏差小于2%，測定數據準確可靠，方法重復性好。

表4 重復性試驗結果

2.4 方法的準確度

對3種飲料進行回收率試驗(表5)。取已知維生素B12含量的樣品，再加入一定量的標準溶液，按照樣品處理方法，進行一系列的操作?；厥章示_到96.5%以上，方法準確度高。

表5 試樣加標回收試驗

3 小結

本試驗采用微生物法測定維生素飲料中維生素B12含量，方法靈敏度高，測定結果準確可靠，方法精密度高，值得經常進行維生素檢測的實驗室應用推廣。但是，微生物法在很多方面依然不易掌握，在檢測過程中應謹慎對待，保證每一步操作符合要求，具體注意以下幾個方面。

準備玻璃儀器時，使用活性劑對玻璃試管及其他必要的玻璃器皿進行清洗，清洗之后200℃干熱2 h，以除去微量生長因子、洗滌劑殘留及某些微生物產生的維生素等。

菌種的復蘇與活化一定要按照該菌種的要求嚴格進行，否則測定中菌種會生長不好，且一定要注意無菌操作避免污染。

試管滅菌時應留有適當的間隙，以保證滅菌過程條件一致，滅菌結束應迅速取出冷卻，避免有色物質產生。

取樣前，應根據其標示值估算取樣量，以保證樣品稀釋后的維生素濃度盡量被標準溶液系列濃度所覆蓋。

每次試驗過程各種條件應盡量保持一致，以保證標準曲線的代表性和有效性、試驗的重復性及符合精密度要求。

［1］GB 5413.14—2010 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定［S］.

［2］張玉杰，呂為群，殷曉紅.奶基嬰幼兒食品中維生素B12活性測定:微生物分析法［J］.生物技術，1993 (8):39-43.

［3］張麗宏，王克新，王淼，等.微生物法測定乳粉中維生素B12的應用和探討［J］.中國乳品工業，2008，10 (215):58-60.

［4］高星，許國慶.微生物法分別測定配方奶粉中的維生素B5及B12［J］.中國乳業，2003 (6):31-33.

［5］GB/T 5009.217—2008 保健食品中維生素B12的測定［S］.

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