玻璃珠表面修飾氨基的新型固相合成載體的制備*

王潔穎, 張首國, 溫曉雪, 彭 濤, 顏海燕, 王 林

(1. 北京工業大學 生命科學與生物工程學院,北京 100022; 2. 軍事醫學科學院 放射與輻射醫學研究所,北京 100850)

固相合成自20世紀60年代問世以來，經過半個多世紀的發展已經由最初的肽合成擴展到各類有機小分子及復雜的天然產物的合成，并以其獨特優勢帶動了組合化學技術的興起[1]。固相合成需要固相載體及連接固相和反應物的連接分子，正確選擇載體和連接分子決定著固相合成的成功[2]。固相合成的載體多以聚苯乙烯和聚丙烯酰胺為基質，主要用于合成多肽[3]。但是, 這兩類高聚物都缺乏結構上的剛性, 在多種溶劑及反應物中都有一定的溶解度。于是, 人們研究開發出了一系列新型固相載體以適應各種反應的需要, 如可控孔度玻璃(CPG)[4]。其他用于固相有機合成載體的材料還有濾紙、塑料棒等，而CPG一般適用于寡核酸的合成。玻璃是一種價廉易得的材料，只需將其加工成特定粒度，加以修飾即可進行固相載體的應用。其優點是具有一定的化學穩定性，基本上不溶于有機溶劑，具有一定的機械強度，良好的抗擠壓和抗研磨性能。最大的優點是來源廣泛，價格低廉，而這些是高聚物和其余的材料所不具備的。因此，開發以玻璃珠為基質的載體進行固相合成具有一定的創新和探索意義。

glass beads

Scheme1

隨著以固相為支撐的蛋白芯片和生物傳感器的發展，蛋白固定化的需求迅速增加。蛋白固定化在很大程度上依賴于基質表面的修飾[5]。由于玻璃能夠耐高溫和浸泡，可以負載微量樣品并保持較低聲噪，對于玻璃表面的修飾研究日漸深入[6]。其中，硅烷氨化是可以引入多種功能基團的最常用的修飾方法[7]。

1與連接分子4-[4-(羥甲基)苯氧基]-甲基苯甲酸(6)經過氨基與羧基縮合反應制得帶連接臂的玻璃珠固相載體(7); 7與Fmoc保護的甘氨酸反應，再脫保護，成功地鍵合甘氨酸，充分證明1作為新型載體的可行性。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

RY-1型熔點儀(溫度計未經校正);島津UV-2501PC型紫外分光光度計;日本電子JNM-ECA-400型超導核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內標)。

玻璃珠(150目～200目),北京天歷創玻璃有限公司;其余所用試劑均為市售分析純。

1.2 1的制備[9,10]

在燒杯中加入純凈水300 mL和玻璃珠30 g,于100 ℃充分攪拌20 min;抽濾,玻璃珠依次在乙醇(75 mL)中于50 ℃，二氯甲烷(75 mL)中于35 ℃超聲洗滌各2 min;置反應溶液[175 mL,V(25%NH3) ∶V(30%H2O2) ∶V(H2O)=1 ∶1 ∶5]中攪拌下于70 ℃反應30 min。用大量水洗滌至中性，置稀鹽酸105 mL[V(37%HCl) ∶V(H2O)=1 ∶6]中攪拌30 min;用大量水洗滌至中性,依次用甲醇、甲醇/甲苯[V∶V=1 ∶1],甲苯超聲洗滌各3 min，真空干燥過夜制得表面羥基化的玻璃珠。

在燒杯中加入Ⅰ 3 mL的甲苯(300 mL)溶液和表面羥基化的玻璃珠，于室溫攪拌30 min。依次用甲醇、甲醇/甲苯、甲苯超聲洗滌各3 min，于120 ℃真空干燥30 min，緩慢降至室溫制得1，真空保存備用。

1.3 連接分子6的制備

在反應瓶中加入對甲基苯甲酸13.6 g(100 mmol)的苯(100 mL)溶液,攪拌下回流(80 ℃) 30 min;加入NBS(N-溴代丁二酰亞胺) 17.8 g(100 mmol),過氧苯甲酰0.2 g,回流反應24 h。蒸除溶劑,殘余物用沸水充分混懸，抽濾，濾餅用大量沸水洗滌,甲醇重結晶得白色晶體對溴甲基苯甲酸(2),產率57.9%, m.p.233 ℃～235 ℃。

在反應瓶中加入2 2.15 g(10 mmol)的無水甲醇(60 mL)溶液,冰鹽浴冷卻，攪拌下滴加氯化亞砜2.06 g(17 mmol),滴畢,于室溫反應過夜。蒸除溶劑，殘余物溶于乙酸乙酯，用去離子水洗滌3次，蒸除溶劑后經柱層析[梯度洗脫劑:A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=12 ∶1～10 ∶1]分離得白色固體對溴甲基苯甲酸甲酯(3) 1.87 g，產率81.5%, m.p.47 ℃～49 ℃;1H NMR(CDCl3)δ: 3.92(s, 3H), 4.55(s, 2H), 7.46(d,J=8.0 Hz, 2H), 8.02(d,J=8.0 Hz, 2H)。

在反應瓶中加入對羥基苯甲醛1.22 g(10 mmol)的丙酮(30 mL)溶液和碳酸鉀1.38 g(10 mmol),攪拌下回流(60 ℃)反應5 min;緩慢滴加32.1 g(9.17 mmol)的丙酮(15 mL)溶液,滴畢,加入碘化鉀0.13 g,回流反應7 h。過濾,濾液蒸干后用乙酸乙酯溶解，去離子水洗滌，蒸除溶劑后經柱層析(梯度洗脫劑:A=12 ∶1～8 ∶1)分離得白色固體4-[4-(甲?；?苯氧基]甲基苯甲酸甲酯(4),產率69.7%;1H NMRδ: 3.87(s, 3H), 5.35(s, 2H), 7.23(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.62(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.90(d,J=8.4 Hz, 2H), 8.01(d,J=8.0 Hz, 2H), 9.89(s, 1H)。

冰鹽浴冷卻,在反應瓶中依次加入NaBH40.15 g(4 mmol)和1 mol·L-1NaOH溶液 8 mL,攪拌使其溶解，加入40.54 g(2 mmol)的甲醇(15 mL)溶液,反應6 h。用2 mol·L-1鹽酸調至pH 1,析出沉淀，過濾，濾餅烘干得白色固體4-[4-(羥甲基基)苯氧基]甲基苯甲酸甲酯(5),產率98.7%。

在反應瓶中依次加入50.54 g(2 mmol)的甲醇(15 mL)溶液和1 mol·L-1NaOH溶液10 mL,攪拌下回流(90 ℃)反應2 h。蒸除溶劑,用2 mol·L-1鹽酸調至pH 2,析出沉淀,抽濾,濾餅烘干得白色固體6 0.39 g,產率74.8%, m.p.212 ℃～214 ℃;1H NMRδ: 4.41(d, 2H), 5.06(t, 1H), 5.19(s, 2H), 6.97(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.23(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.55(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.96(d,J=8.0 Hz, 2H), 12.98(s, 1H)。

1.4 甘氨酸在1上的鍵合

在反應瓶中加入6 0.26 g(1 mmol)和混合溶劑(CH2Cl210 mL+DMF 2 mL),攪拌使其溶解,依次加入HOBt(1-羥基苯并三唑)0.15 g(1.1 mmol), NMM(N-甲基嗎啉)0.30(3 mmol), TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸)0.32 g(1 mmol),充分攪拌15 min后加入1 22.5 g(氨基含量0.2 mmol),攪拌下于室溫反應2 h(茚三酮檢測玻璃珠不再顯色)。抽濾，玻璃珠依次用二氯甲烷、甲醇、乙醚洗滌，烘干得7。

在反應瓶中加入Fmoc保護的甘氨酸0.30 g(1 mmol)和混合溶劑(CH2Cl210 mL+DMF 2 mL),攪拌使其溶解,依次加入HOBt 0.15 g(1.1 mmol), DIC(N,N-二異丙基碳二亞胺)0.13 g(1 mmol),充分攪拌后加入7和少量DMAP(4-二甲氨基吡啶),于室溫反應18 h。抽濾，玻璃珠依次用二氯甲烷、甲醇、乙醚洗滌;置混合溶劑[10 mL,V(醋酐) ∶V(DMF)=1 ∶4]中，攪拌下反應1 h。抽濾，玻璃珠依次用二氯甲烷、甲醇、乙醚洗滌,烘干得7連接Fmoc保護甘氨酸(8)。

在反應瓶中加入8和混合溶劑30 mL[V(哌啶) ∶V(DMF)=1 ∶4],攪拌下于室溫反應4 h(茚三酮檢測玻璃珠不再顯色)。依次用甲醇、二氯甲烷、乙醚洗滌，烘干得7連接甘氨酸(9)。

2 結果與討論

按文獻[8]方法測得1的氨基含量為8.9×10-3mmol·g-1。趙劍英等[11]在測定不同硅烷氨化試劑修飾玻璃表面后，測定的單層膜氨基密度約為2.1×1020個·m-2。1的氨基密度為2.2×1020個·m-2,與其它研究結果基本相當。

在1上連接側鏈及氨基酸需要三步才能完成，中間步驟無法準確判斷產率。脫去甘氨酸Fmoc保護后測定9的氨基含量為4.1×10-3mmol·g-1,由此計算產率為46.2%，實為三步的總產率，因此可以推斷出每步平均產率為77.3%。

3 結論

1的表面功能基團為氨基，可以與多種基團反應，因此可連接不同基團，從而制備所需要的連接臂，滿足不同的合成需求。低負載量的1可以適用于高分子量化合物的固相合成。

實驗中采用的側鏈類似于wang樹脂側鏈，氨基酸采用的是Fmoc保護策略。同樣氨基酸也可以采用Boc保護策略，而側鏈可以采用類似于Merrifield的側鏈。在合成寡核酸時一般需要將CPG進一步衍生出氨基和引出合適的連接臂以便連接第一個核苷[12]。因此在玻璃珠進行氨基化之后，可以引入合適的連接臂，然后進行寡核酸的制備。

[1] 王德心. 固相有機合成[M].北京:化學工業出版社,2004.

[2] Zhang Z G, Cai H B, Bai L,etal. A comparison between the yield of the attachment of Boc-AA-O-Cs+to Merrifield resin and Fmoc-AA-OH to wang resin[J].Chinese J Org Chem,2000,20(3):419.

[3] Guillier F, Orain D, Bradley,M. Linkers and cleavage strategies in solid-phase organic synthesis and combinatorial chemistry[J].Chemical Reviews,2000,100(6):2091-2158.

[4] K?ster H, Stumpe A, Wolter T. Polymer support oligonucleotide synthesis 13:Rapid and efficient synthesis of oligodeoxynucleotides on porous glass support using triester approach[J].Tetrahedron Letters,1983,24:747-750.

[5] Catherine M H, Anthony E G. A factorial analysis of silanization conditions for the immobilization of oligonucleotides on glass surfaces[J].Anal Chem,2001,73(11):2476-2483.

[6] Jaffar S, Belcher A. Layer-by-layer surface modification and patterned electrostatic deposition of quantum dots[J].Nano Letters,2004,4(8):1421-1425.

[7] Tillman N, Ulman A, Schildkraut J S,etal. Incorporation of phenoxy groups in self-assembled monolayers of trichlorosilane derivatives.Effects on film thickness,wettability,and molecular orientation[J].J Am Chem Soc,1988,110(18):6136-6144.

[8] 黃惟德,陳常慶. 多肽合成[M].北京:科學出版社,1985.

[9] Zhao J Y, Li Y H. Relative surface density and stability of the amines on the biochip[J].Chin J Anal Chem,2006,34(9):1235-1238.

[10] Vincent K S, John R. Aminopropyltriethoxysilane(APTES)-functionalized nanoporous polymeric gratings:Fabrication and application in biosensing[J].J Mater Chem,2007,17:4896-4901.

[11] 趙劍英,李玉邯,高連勛. 第三屆全國微全分析系統學術會議[C].北京:中國化學會,2005.

[12] Lautent A, Lambert B, Charreyre M T,etal. A one step derivatization of controlled pore glass for oligonucleotide solid-phase synthesis[J].Tetrahedron Letters,2004,45:8883-8887.