比伐盧定的聚乙二醇化修飾*

何 燕, 鄧言波, 王良友

(1. 蘇州大學 醫學部 放射醫學與防護學院,江蘇 蘇州 215123; 2. 蘇州中科天馬肽工程中心有限公司,江蘇 蘇州 215101)

比伐盧定(BVLD)是由20個氨基酸(D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu)組成的水蛭素的衍生物，是凝血酶的直接可逆的二價抑制劑[1],可以與凝血酶的催化位點和陰離子結合位點(底物識別位點)結合[2]。BVLD于2000年12月15日被美國FDA批準上市。

BVLD是一種合成的多肽藥物，單次劑量為250 mg,價格昂貴。其在腎功能正常的患者體內的清除半衰期為25 min,雖然比伐盧定于2000年被批準用于經皮冠狀動脈腔內血管成形術的抗凝治療，在2005年被批準用于接受經皮冠狀動脈介入治療的抗凝治療[3],但是昂貴的價格限制了其在臨床上的應用。因此，開發長效、安全、經濟的類似藥物十分必要。蛋白質經聚乙二醇化修飾(PEGylation)后能顯著改善其特性，如增加蛋白質對酶的穩定性、延長蛋白質在血漿中的半衰期、降低抗原性和免疫原性等[4]，已有多個PEG修飾的蛋白藥物上市[5]。

本文將BVLD多肽鏈7-甘氨酸(Gly)用半胱氨酸(Cys)取代，以PEG定點修飾巰基，采用多肽固相合成法制得[Cys]7-BVLD(2); 2與mPEG-MAL(3a～3c)偶聯合成了三個PEG修飾的BVLD衍生物——[Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD(1a), [Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD(1b)和[Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD(1c),其結構經MS確證。PT和TT評價結果表明，1a～1c均表現出良好的抗凝活性，尤其是1b的抗凝活性優于BVLD。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

創新通恒半制備高效液相色譜儀[Phenomenex C18柱,250 mm×30 mm(100 ?，10 μ),流動相A: 0.05%TFA水溶液,B: 0.05%TFA(三氟乙酸)/70%CH3CN/H2O,流速20 mL·min-1,檢測波長215 nm];戴安U3000型高效液相色譜儀[HPLC, Prosphere C18柱,250 mm×4.6 mm(100 ?, 5 μ),流動相同前，流速1 mL·min-1]; Bruker MTQ型質譜儀。

固相合成載體CTC樹脂(原始替代度為1.3 mmol·g-1), DCC(N,N′-二環己基碳二亞胺), HOBt(1-羥基苯并三氮唑)以及10 種Fmoc-保護氨基酸,上海吉爾生化公司;TFA, Acros; EDT(乙二硫醇)和TMBS(三甲基溴硅烷), Fluka;聚乙二醇的平均分子量為mPEG2000-OH, mPEG5000-OH和mPEG10000-OH, Sigma;其余所用試劑為分析純。

1.2 合成

(1) mPEG-MAL(3a～3c)的合成通法

在反應瓶中依次加入mPEG-OH 1 mmol的CH2Cl2(5 mL)溶液,Et3N 6 mmol和對甲苯磺酰氯6 mmol，攪拌下于室溫反應20 h(TLC監測)。于40 ℃減壓旋蒸除去溶劑，加預冷無水乙醚沉降，過濾，濾餅用二氯甲烷溶解，依次用0.1%檸檬酸鈉溶液(3×10 mL)，飽和NaCl溶液(3×足量)洗滌，無水Na2SO4干燥12 h,于40 ℃減壓旋蒸除去溶劑，乙醚沉降，抽濾，濾餅干燥得白色粉末mPEG-OTs(Ⅰa～Ⅰc)。

在反應瓶中依次加入Ⅰa～Ⅰc1 mmol的DMF(10 mL)溶液,鄰苯二甲酰亞胺鹽(PPI) 6 mmol, N2保護下于120 ℃反應4 h。于90 ℃減壓旋蒸除去溶劑，依次加入無水乙醇與水合肼， 回流反應2 h。于60 ℃減壓旋蒸除去溶劑，殘余物用二氯甲烷溶解，過濾，濾液依次用水(3×10 mL)，飽和NaCl溶液(3×足量)洗滌，無水Na2SO4干燥12 h,于40 ℃減壓旋蒸除去溶劑，乙醚沉降，抽濾，濾餅干燥得白色粉末mPEG-NH2(Ⅱa～Ⅱc)。

在反應瓶中加入Ⅱa～Ⅱc1 mmol的二氧六環(40 mL)溶液，攪拌下于80 ℃加馬來酸酐4 mmol,反應30 min。于55 ℃減壓旋蒸除去溶劑，乙醚沉降，抽濾，濾餅用醋酸酐溶解，加入無水醋酸鈉，攪拌下于100 ℃反應45 min(反應液由淡黃色逐漸變為褐色液體)。加水(10倍體積),分液，水層用CH2Cl2(3×10 mL)萃取，合成并有機層，用飽和NaCl溶液(3×足量)洗滌，無水Na2SO4干燥12 h,于40 ℃減壓旋蒸除去溶劑，乙醚沉降，抽濾，濾餅干燥得淡黃固體3a～3c。

Ⅰa～3c的產量及產率見表1。

(2) [Cys]7-BVLD(2)的制備

CTC樹脂15.00 g, HOBt和HBTu為縮合劑，按照反應的投料比，稱取相應量的Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Tyr(tBu)-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH， Fmoc-Pro-OH， Fmoc-Ile-OH， Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH， Fmoc-Gly-OH， Fmoc-Asn(Trt)-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH， Fmoc-D-Phe-OH和Fmoc-Arg(Pbf)-OH，根據[Cys]7-BVLD的氨基酸順序，按標準的Fmoc固相多肽合成方法(圖1)合成 D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Cys7(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-CTC(2-CTC)。按照8 mL·g-1樹脂用量配制并加入裂解液，以混合溶劑[V(TFA) ∶V(苯甲硫醚) ∶V(EDT) ∶V(苯甲醚)=90 ∶5 ∶3 ∶2]為裂解液，于0 ℃反應90 min。過濾，濾液旋轉蒸發除去TFA，加冷凍無水乙醚(6倍體積)沉淀出白色固體，3 000 rpm離心5 min，濾集固體用水溶解，冰凍干燥至恒重得白色干粉2粗品62 mg。

表 1 Ⅰa～3c的產量及產率Table 1 Output and yield of Ⅰa～3c

圖1Fmoc固相多肽合成2-CTC的流程圖
Figure1The flow chart of the Fmoc solid phase peptide synthesis of 2-CTC
*V(六氫吡啶) ∶V(DMF)=1 ∶3

2粗品經HPLC純化得2,純度大于95%(HPLC),其結構經MS和氨基酸組成分析確證。由MS分析可知，在1 112.2處有主峰，與理論分子量2 223.99分子帶兩個電荷一致。2經酸性水解(6 mol·L-1鹽酸水溶液，于110 ℃反應22 h，下同)的氨基酸組成實測值與理論值(括號內)相符:Asp 1.99(2), Glu 4.11(4), Pro 3.09(3), Arg 0.96(1), Gly 4.21(4), Tyr 1.07(1), Phe 1.92(2), Ile 0.99(1), Leu 0.98(1)。

(3)1a～1c的合成通法

在反應瓶中加入2的水(10 mL)溶液,用5%碳酸氫鈉溶液調至pH 7～8，加入3a～3c，于室溫反應至終點(HPLC監測)。HPLC分離提純得1a～1c,純度大于95%, MALDI-TOF-MS分析結果表明，在4 232附近有一系列峰，相鄰兩峰分子量相差約44，具有聚乙二醇的典型結構特征。經酸性水解的氨基酸組成實測值與理論值(括號內)相符。1a: Asp 1.99(2), Glu 4.11(4), Pro 3.09(3), Arg 0.96(1), Gly 4.21(4), Tyr 1.07(1), Phe 1.92(2), Ile 0.99(1), Leu 0.98(1)。1b: Asp 2.00(2), Glu 4.31(4), Pro 3.18(3), Arg 1.03(1), Gly 4.13(4), Tyr 1.02(1), Phe 1.82(2), Ile 1.06(1), Leu 1.03(1)。1c: Asp 1.95(2), Glu 4.06(4), Pro 2.92(3), Arg 0.96(1), Gly 4.21(4), Tyr 1.06(1), Phe 1.92(2), Ile 1.01(1), Leu 0.97(1)。

1.3 1的抗凝活性評價

(1)1的凝血酶原時間(PT)測定

將PT試劑和受檢血漿置37 ℃水浴中預溫5 min。取試管1支，加入受檢血漿0.1 mL，一定量的比伐盧定或1(用pH 7.4的Tris-HCl緩沖液配制成所需終濃度)，置37 ℃水浴中預溫30 s，再加入預溫的PT試劑0.2 mL，混勻，立即啟動秒表計時。不斷地傾斜試管至液體流動緩慢趨于停止時，記錄所需時間。重復三次，取平均值，空白對照為Tris-HCl緩沖液，測試結果見表2。

表 2 1的PT評價數據*Table 2 PT evaluation data of 1

*終濃度/μg·mL-1, 凝固時間欄括號內為標準差

由表2可見，1a～1c不僅在等質量濃度測定條件下仍保留了一定的抗凝活性；而且在等摩爾濃度下也保持了良好的抗凝活性，其中1b的抗凝活性優于比伐盧定。

(2)1的凝血酶時間(TT)測定

取受檢血漿0.1 mL于試管中，加入一定量的比伐盧定或1(用pH 7.4的Tris-HCl緩沖液配制成所需終濃度)，置37 ℃水浴中，預溫5 min，再加入0.1 mL標準化“凝血酶”試劑，同時啟動秒表記錄血漿凝固時間。重復三次，取平均值，測試結果見表3。從表3可以看出，1a～1c均具有較好的抗凝活性(正常對照平均值18.0 s)。

表 3 1的TT評價數據Table 3 TT evaluation data of 1

表 4 1的APTT評價數據(等質量濃度)*Table 4 APTT evaluation data of 1

*終濃度0.04 μg·mL-1

(3) 1的活化部分凝血酶時間(APTT)測定

取APTT反應液0.1 mL和受檢血漿0.1 mL于塑料離心管中，并加入5 μL的比伐盧定或1(用pH 7.4的Tris-HCl緩沖液配制成終濃度0.04 μg·mL-1的溶液)，置 37 ℃水浴中預溫3 min。再加入預溫的APTT催化劑0.1 mL，混勻，立即啟動秒表計時。不斷地傾斜試管至有絮狀沉淀生成時，記錄所需時間。重復三次，取平均值，測試結果見表4。由表4可見，1a～1c仍保持了良好的抗凝活性，其中，1b的抗凝活性最佳。

2 結果與討論

比伐盧定的構效關系研究表明，其氨基端帶正電荷區域(D-Phe-Pro-Arg-Pro)和羧基端帶負電荷區域(Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu)是其與凝血酶結合的兩個關鍵區域，而5-位至8-位的4個Gly只起連接作用，因此選擇7-位或8-位的甘氨酸進行聚乙二醇修飾是理想的位點。初步活性評價表明，本研究合成的三種不同平均分子量的1a～1c能保持較好的體內抗凝活性，在相同摩爾濃度下，1b的抗凝活性優于比伐盧定，有望進一步開發成具有比比伐盧定更長半衰期的抗凝藥物。

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