山奈素與牛血清蛋白相互作用:Tachiya模型與Stern－Volmer方程的對比研究

陶慧林，黎舒懷，徐銘澤，周素蓮，劉帥濤，易忠勝

(桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004)

隨著光譜技術的不斷發展，以靈敏度高、信號穩定為特征的熒光光譜法已成為研究藥物及其他小分子物質與蛋白質間相互作用的重要手段［1－3］。山奈素(Kaempferide，KF)化學名為4-甲氧基-3，5，7-三羥基黃酮(見圖1)，是一種廣泛分布在高等植物中的黃酮類化合物，具有祛痰、防治咳嗽和哮喘、降低血壓、降血脂、抗動脈硬化等多種生物功能［4］。在腫瘤臨床治療的應用上，KF與化療藥物的聯合應用可起到協同增效的抗腫瘤作用，可望成為有效的抗癌防癌的治療及保健制劑［5］。目前對于KF與牛血清蛋白(BSA)相互作用的研究主要集中在單純的熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法［6－7］，得到的信息有限，不能滿足進一步研究的需要。

本實驗利用熒光光譜和紫外可見吸收光譜法，首次采用Tachiya模型與Stern－Volmer方程比較研究了生理條件下KF與BSA之間的相互作用，對二者相互作用的模式、作用力類型以及熱力學性質等方面作出闡釋。為闡明藥物與白蛋白的作用機制，了解藥物在生命體內的存儲和運輸情況，進一步研究天然黃酮類化合物在生物體內的作用提供了重要信息。

圖1 山奈素的分子結構式Fig.1 Molecular structure of kaempferide

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度計(日本島津);Carry-50型紫外－可見吸收光譜分光光度計(美國瓦里安);EL204電子分析天平;PT-10便攜式pH計。

山奈素(生化試劑，99.0%):用無水乙醇配制成3.494×10－3mol/L儲備溶液，使用時移取適量儲備溶液，用二次水稀釋至1.0×10－4mol·L－1;牛血清白蛋白(BSA，國藥集團化學試劑有限公司):用 pH 7.4 的 Tris－HCl緩沖溶液(含 0.10 mol·L－1NaCl以維持離子強度)配制 1.0 ×10－5mol·L－1的BSA儲備溶液，于4℃以下保存備用。其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

在10 mL比色管中準確移入1.00 mL 1.0×10－5mol·L－1BSA溶液，用微量注射器依次加入不同量的KF溶液，用pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液定容至10 mL。在設定溫度(298、304、310 K)下于恒溫水浴中靜置5 min。設定激發光柵和發射光柵的狹縫寬度為3.0 nm/5.0 nm，激發波長為280 nm，恒溫掃描BSA在290～500 nm的熒光發射光譜。分別固定Δλ=15 nm及Δλ=60 nm，記錄KF與BSA混合溶液的同步熒光光譜。測定物質的量濃度比為1∶1的KF與BSA溶液的紫外吸收光譜及熒光發射光譜。

圖2 298 K時KF對BSA的熒光猝滅圖Fig.2 Fluorescence quenching spectra of BSA in the presence of KF at 298 K

2 結果與討論

2.1 應用Stern－Volmer方程研究KF與BSA相互作用

2.1.1 KF對BSA的熒光猝滅光譜 將BSA的濃度固定，逐漸增大KF溶液的濃度，熒光猝滅圖如圖2所示。BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基使其具有內源性熒光，在348 nm處有最大熒光峰。隨著KF濃度的增加，BSA的熒光強度明顯降低，這表明KF和BSA之間發生了結合作用。此外，BSA的最大發射波長出現藍移，表明隨著KF濃度的增大BSA發色團的疏水環境發生了改變。

2.1.2 KF對BSA熒光猝滅機理及猝滅常數的確定

通過Stern－Volmer方程［8］分析熒光猝滅數據:

式中:Kq為雙分子猝滅過程速率常數，KSV為動態猝滅常數，τ0為無猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光壽命約為10－8s，F0和F分別為未加入和加入KF時BSA的熒光強度，［Q］為猝滅劑KF的濃度。KF和BSA之間相互作用的Stern－Volmer猝滅常數KSV及相關系數r計算結果見表1。

表1 不同溫度下KF與BSA相互作用的Stern－Volmer猝滅常數Table 1 Stern－Volmer constant of interaction between KF and BSA at different temperatures

圖3 不同溫度下KF對BSA熒光猝滅的雙對數曲線Fig.3 The double logarithmic curves for the quenching of BSA fluorescence by KF at different temperatures

對于動態猝滅，各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數約為 2 ×1010L·mol－1·s－1［9］。此外，動態和靜態猝滅可根據猝滅常數KSV隨溫度的變化關系加以判斷。對于靜態猝滅，KSV值隨著溫度升高而降低，而對于動態猝滅，溫度的升高將增加有效碰撞和加劇電子轉移過程，使熒光猝滅常數隨溫度升高而增大［10］。結果表明該反應的 Kq值大于2.0×1010L·mol－1·s－1，且 KSV的值隨著溫度升高而降低，表明猝滅是靜態猝滅，反應形成了BSA－KF基態復合體。

2.1.3 結合常數及結合位點數 當小分子與大分子結合時，其結合常數與結合位點數可從下式獲得［11］:

式中n為結合位點數，Ka為表觀結合常數，由上式作lg(F0/F－1)～lg［Q］圖(見圖3)。圖中直線的斜率即結合位點數n，截距即lgKa，依直線的斜率和截距即可求出KF與BSA相互作用的結合常數Ka及結合位點數n(見表2)。結果表明，KF和BSA之間存在強大的結合力，并且結合常數Ka隨著溫度升高而增大，這表明升高溫度后KF與BSA的結合能力增強，從而導致BSA－KF復合體的穩定性增大。n值接近于1，表明KF與BSA具有一個結合位點。

表2 通過Stern－Volmer方程得到的KF與BSA相互作用的結合常數Table 2 Binding parameters obtained from the interaction of KF with BSA by Stern－Volmer equation

2.1.4 熒光給體－受體間距離的求取 根據F rster偶極－偶極非輻射能量轉移理論［12］，發生能量轉移時，非輻射能量轉移效率E、供能體與受體之間的結合距離r及臨界能量轉移距離R0之間有下列關系:

式中K2=2/3;R0是E=50%時的臨界距離;N為介質折射常數，取水和有機物折射指數的平均值1.336;Φ為血清白蛋白的熒光量子產率，通常取蛋白質中色氨酸的量子產率0.15［13］;J為給體熒光發射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。圖4為298 K(A)、304 K(B)、310 K(C)溫度下，BSA的熒光光譜與KF的紫外吸收光譜的重疊圖譜。

圖4 BSA熒光光譜與KF吸收光譜的重疊圖Fig.4 Overlap spectra of BSA's fluorescence emission spectra(1)and kaempferide's UV absorption spectra(2)temperature(A－C):298，304，310 K;cBSA=cKF=1.0×10－5mol·L－1

由式(3)～(6)分別求得不同溫度下的能量轉移效率E、KF在BSA上的結合位點以及蛋白質分子中的214位色氨酸殘基的距離r，結果如表3所示。由結果可知，KF在BSA上的結合位點與蛋白質分子中的色氨酸殘基Trp 214的距離r＜7 nm，具備了能量轉移猝滅蛋白質熒光的條件，因此非輻射能量轉移也是引起熒光猝滅的原因之一。另外，在溫度為298、304 K時，由于結合距離r小于能量轉移效率為50%時的臨界距離R0，說明非輻射能量轉移引起蛋白質熒光峰猝滅的幾率比靜態猝滅大，因此非輻射能量轉移是KF引起BSA熒光猝滅的主要原因。隨著溫度升高，能量轉移效率為50%時的臨界距離R0與結合距離r均逐漸增大，并在310 K時，能量轉移效率為50%時的臨界距離R0約等于藥物與蛋白質的結合距離，因此推測人體生理溫度下，非輻射能量轉移與靜態猝滅共同導致了BSA的熒光猝滅。

表3 BSA熒光光譜與KF吸收光譜重疊積分J與結合距離rTable 3 The overlap integral and binding distances between fluorescence spectra of BSA and absorption spectra of KF

2.2 利用Tachiya模型研究山奈素與蛋白質相互作用

2.2.1 Tachiya模型［14－15］分子與蛋白質之間的吸附與解吸可用下式表示:

式中，Qaq表示猝滅劑分子，Bn表示帶n個猝滅劑的BSA。如果BSA中結合位點為m，假設式(7)中的速率常數是合理的:

式中，nav是生物分子中結合的猝滅劑的平均數目，可以通過下式計算得到nav:

在式(12)和式(13)中消去［Qaq］，可以得到:

從BSA到猝滅劑的F rster能量轉移速率常數為:

τ0為沒有猝滅劑存在時BSA的熒光壽命，r是BSA與猝滅劑之間的距離，R0是F rster非輻射能量轉移距離。如果生物分子在與BSA有相同距離r處有n個結合的猝滅位點，熒光強度會變為:

在有無猝滅劑存在的情況下，二者猝滅強度的比值為:

nav可由式(14)求出。通過實驗可以獲知［M］、［Q］和F/F0的值，結合式(17)和(14)，可以計算出未知變量m、K和r的值，它們均由方程(17)所擬合出的F/F0～［Q］＆［M］曲線所決定。對固定的［M］值，F/F0會隨［Q］值增大而減小。然而［Q］值足夠大時，F/F0會飽和。因為當所有BSA的結合位點都被猝滅劑占去后，繼續增大［Q］不再使結合的猝滅劑數目增加。飽和時猝滅劑結合的數目如下:

因此飽和時的熒光強可以表示為:

另外，［Q］足夠小時生物的平均猝滅結合數目也很小，可結合式(14)計算得到:

情況 3.2 {1,2,3}不是X中頂點色集合,以下僅考慮31≤n≤34時的情況,此時C中至多有3個集合不是X和Y中頂點色集合。

此種情況下猝滅結合數目的分布約等于:

從而得出熒光強度為:

此處nav可由式(20)得到。

2.2.2 結合常數與結合距離的求取 通過式(22)可知，當［Q］足夠低時，F/F0與［Q］成比例，且比例系數由K、r和［M］決定。因此K、r的值可以由測量兩個不同［M］值時的F/F0～［Q］曲線來確定。不同溫度下的F/F0～［Q］曲線如圖5所示。

圖5 不同溫度時的F/F0～KF濃度關系圖Fig.5 Curves of F/F0versus concentration of KF obtained by the Tachiya model at different temperatures A.298 K，B.304 K，C.310 K;cBSA: .10 μmol·L －1， .5 μmol·L －1

由式(22)可得BSA與KF相互作用的結合常數K如表4所示，結合常數K隨溫度的增加而增大，這種趨勢與Stern－Volme方程得到的結果一致。但由Stern－Volme方程得到的結合位點數幾乎不隨溫度變化而變化，而由Tachiya模型得到的實際結合位點數卻隨溫度的變化而變化很大。這主要是由于Tachiya模型將結合位點數m與分子實際結合位點數n進行了區別考慮，而Stern－Volmer方程是假定結合位點數即是藥物分子實際結合在蛋白質上的數量，這可能并不符合實際情況。Tachiya模型得到的結果更符合小分子與生物大分子相互作用的實際情況。

表4 通過Tachiya模型得到KF－BSA相互作用的結合參數Table 4 The binding parameters of KF－BSA system by Tachiya model

另外，由Tachiya模型得到的結合距離r與Stern－Volmer方程計算的結果亦有較大區別。但兩種方法計算出的結合距離r均在2～7 nm范圍內，表明由藥物向BSA發生能量轉移的幾率較大，具備了能量轉移猝滅蛋白質熒光的條件，因此非輻射能量轉移是引起熒光猝滅的原因之一。

2.2.3 熱力學參數及作用力類型的求取 小分子和生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵、靜電作用、范德華力、疏水力4種［16］。假設在測定溫度范圍內焓變變化不大，則焓變和熵變ΔS可以從Van t Hoff方程求得:

K近似于在相應溫度下Stern－Volmer方程中相互作用體系的結合常數Ka，通過lnK對1/T作圖可以得到方程式:lnK=－21 635/T+84.870，r=0.998 6。根據該公式計算得到ΔH和ΔS，再由ΔG=－RTlnK計算ΔG，結果如表5所示。

Ross等［16］根據大量的實驗結果，總結出生物大分子與有機小分子等結合力性質與結合作用熱力學函數之間的關系，根據反應前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷藥物與蛋白質之間的主要作用力類型:ΔH＞0，ΔS＞0為疏水作用力;ΔH＜0，ΔS＜0為氫鍵和范德華力;ΔH≈0，ΔS＞0為靜電引力。由表5可知，該反應是自發反應(ΔG ＜0);ΔH＞0，ΔS＞0，說明KF與BSA之間的作用力為疏水作用力。

表5 KF－BSA相互作用的熱力學常數Table 5 The thermodynamic parameters of KF－BSA interaction

2.3 KF對BSA構象的影響

蛋白質的同步熒光光譜常被用來判斷蛋白質的構象變化。對于蛋白質的同步熒光光譜，Δλ=15 nm時只表現出酪氨酸殘基的熒光，Δλ=60 nm時僅表現出色氨酸殘基的熒光。因為氨基酸殘基的最大熒光與其所處環境的疏水性有關，所以由熒光波長的改變可判斷蛋白質構象的變化［17］。本實驗固定激發波長和發射波長的間距為Δλ，同步掃描KF與BSA體系的同步掃描光譜以考察BSA的構象變化(圖6)。

圖6 KF與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of interaction of KF with BSA A.Δλ =15 nm，B.Δλ =60 nm;cBSA=1.0×10－6mol·L－1;cKF=0.0－3.0(×10－6mol·L－1)

由圖6可觀察到，固定蛋白質濃度，隨著KF濃度的增加，BSA分子中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光均被猝滅。KF使BSA的酪氨酸特征熒光峰發生了微弱的紅移，表明該殘基所處環境的疏水性減弱;色氨酸特征熒光峰發生了微弱的紫移，表明該殘基所處環境的疏水性有所增加，蛋白質變得緊密［18］。KF的加入使BSA的構象發生了變化，推測KF與BSA的相互作用可能是通過與色氨酸殘基的結合而實現的。

3 結論

利用熒光光譜與紫外可見吸收光譜研究了不同溫度下，KF與BSA之間的相互作用。使用Tachiya模型與Stern－Volmer方程，探討了兩種不同數學模型對相互作用體系計算結果的影響。結果表明，使用Tachiya模型時，結合常數Ka隨溫度的增加而增大，這種趨勢與Stern－Volmer方程得到的表觀結合常數的變化趨勢一致。但由Stern－Volmer方程得到的結合位點數幾乎不隨著溫度變化而變化，而由Tachiya模型獲得的實際結合位點數隨溫度的變化而發生明顯變化。Tachiya模型得到的結果更符合小分子與生物大分子相互作用的實際情況。熱力學數據表明KF與BSA之間主要依靠疏水作用力結合。同時同步熒光光譜發現KF與BSA的作用可能是通過與色氨酸殘基的結合而實現的。

［1］Yu Y M，Feng J C，Liu Y.Acta Chim.Sin.(余燕敏，馮金朝，劉穎.化學學報)，2011，69(2):190－198.

［2］Li C X，Liu S P，Liu Z F，Hu X L.Acta Chim.Sin.(李翠俠，劉紹璞，劉忠芳，胡小莉.化學學報)，2011，69(12):1408－1414.

［3］Zhang X，Kou Z N，Shi Y J，Zhu J B.J.Instrum.Anal.(張曦，寇自農，石羽佳，朱靖博.分析測試學報)，2011，30(4):444－447.

［4］Chang X Q ，Ding L X.Handbook of Analysis of Active Constituents of Chinese Material Medicine.Beijing:Xueyuan A-cademy Press(常新全，丁麗霞.中藥活性成分分析手冊.北京:學苑出版社)，2002:218.

［5］N r J E，Christensen J，Liu J，Peters M，Mooney D J，Strieter R M，Polverini P J.Cancer Res.，2001，61(5):2183－2188.

［6］Tian J M，Liu J Q，Tian X N，Hu Z D，Chen X G.J.Mol.Struct.，2004，691(1/3):197－202.

［7］Shi J，Cao H.Rev.Bras.Farmacogn.，2011，21(4):594 －600.

［8］Lakowicz J R，Masters B R.J.Biomed.Opt.，2008，13(2):029901 －029902.

［9］Xu J G，Wang Z B.Fluorescence Analytical Methods.Beijing:Science Press(徐金鉤，王尊本.熒光分析法.北京:科學出版社)，2006:65.

［10］Yang P，Gao F.The Principles of Bioinorganic Chemistry.Beijing:Science Press(楊頻，高飛.生物無機化學原理.北京:科學出版社)，2002:331.

［11］Zhao H W，Ge M，Zhang Z X，Wang W F，Wu G Z.Spectrochim.Acta Part A，2006，65(3):811－817.

［12］F rster T.Ann Physik，1948，2:55 －75.

［13］Feng X Z，Bai C L.Chin.J.Anal.Chem.(馮喜增，白春禮.分析化學)，1998，26(2):154－157.

［14］Xiao J B，Chen X Q，Jiang X Y，Hilczer M，Tachiya M.J.Fluoresc.，2008，18(3):671－678.

［15］Tachiya M.J.Chem.Phys.，1982，76:340.

［16］Ross P D，Subramanian S.Biochemistry，1981，20(11):3096－3102.

［17］Hu Y J，Liu Y，Wang H B，Xiao X H，Qu S S.J.Pharm.Biomed.Anal.，2004，36(4):915 －919.

［18］Pan Z T，Ma Y，Wang W.Chin.J.Anal.Lab.(潘祖亭，馬勇，王巍.分析試驗室)，2004，23(1):5－8.