凝膠滲透色譜－固相萃取/高效液相色譜法同時測定水產品中甲基睪酮與己烯雌酚

李佩佩，郭遠明，陳雪昌，張小軍，梅光明，劉 琴

(浙江省海洋水產研究所 浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江 舟山 316100)

甲基睪酮(Methyltestosterone，MET)和己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)屬同化激素，分別作為人工合成的雄性和雌性激素，對促進蛋白合成和提高產量具有較強作用，可大幅度提高動物養殖的經濟效益［1］。然而其在人體的極小殘留也會造成人內分泌紊亂、性早熟、胎體中毒、致畸致癌等嚴重后果［1］。因此美國和歐盟等國家和組織通過立法限制或禁止食用性動物飼養中使用此類激素［2］，我國農業部也將這兩種激素列入禁止用于所有食品動物藥品目錄［3］。有資料報道水產業飼料中有甲基睪酮和己烯雌酚違法添加現象，因此快速、準確檢測這兩種激素對于水產品安全監控具有重要意義。

目前甲基睪酮和己烯雌酚的檢測方法主要有氣相色譜－質譜法［4－6］、高效液相色譜法［7－9］、高效液相色譜－串聯質譜法［10－15］等。已有的水產行業標準將甲基睪酮和己烯雌酚分別測定，也有文獻采用液相色譜－質譜法將兩者與其它同化激素同時測定［16］。本文采用凝膠滲透色譜凈化樣品，經固相萃取再次凈化后進高效液相色譜測定水產品中的甲基睪酮和己烯雌酚，成功解決了同化激素前處理過程中的基質干擾問題。本方法回收率較高、檢出限較低、檢測效率較高，適用于水產品中兩種激素的同時常規檢測，同時也適用于脂肪含量較高的水產品。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀(配2489紫外檢測器，美國Waters公司);GPC Ultra全自動凝膠凈化在線濃縮系統(德國LCtech公司);T18勻漿機、MS2漩渦混合器(德國IKA公司);Centrifuge 5810高速離心機(Eppendorf公司);N－EVAP112氮吹儀(Organomation公司);R－215旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司);固相萃取裝置(美國Agilent公司);Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL，美國Waters公司)。

甲基睪酮、己烯雌酚標準品(純度＞99%，德國Dr Ehrenstorfer公司):分別用甲醇溶解并配制成100 mg/L的標準儲備液，再根據需要稀釋成相應的混合標準工作液。乙醚、甲酸、甲醇(色譜純)，環己烷、乙酸乙酯(農殘級)均為Merck公司產品;Na2CO3(分析純，上海國藥試劑集團);實驗用水為Milli-Q制備超純水;其他試劑均為分析純。

1.2 樣品前處理

實驗所用的水產品為草魚、對蝦和鰻鱺，按照SC/T3016的規定處理后于－18℃冰箱密封保存。

稱取(5±0.02)g充分勻漿的樣品于50 mL離心管中，加入15 mL乙醚和2 mL 10%的Na2CO3溶液，加塞漩渦混勻5 min，超聲提取5 min，6 000 r/min離心5 min，吸取上清液至100 mL雞心瓶中，向下層殘渣中再加入15 mL乙醚重復提取一次，合并上清液至雞心瓶中于35℃下緩慢旋轉蒸干。用10 mL乙酸乙酯－環己烷(1∶1，體積比)分兩次充分溶解殘渣，經0.45 μm有機濾膜過濾后轉移至GPC專用濃縮小瓶中。放置好濃縮瓶和收集瓶，開始GPC凈化。收集24～35 min的餾分，40℃下氮吹至干。加入4 mL 10%的甲醇水溶液，漩渦混勻后過HLB柱(使用前用4 mL甲醇和4 mL水活化)，以20%甲醇水溶液淋洗，低真空抽干或擠干，以4 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于40℃水浴下氮吹至干，殘渣用1 mL流動相充分溶解，經0.22 μm濾膜過濾后進HPLC檢測。

1.3 色譜條件

色譜柱:X－Bridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－水(72∶28);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:20 μL;檢測器:紫外檢測器，檢測波長:254 nm。

1.4 GPC條件

柱子類型:GPC 10010(500 mm×25 mm);填料:50.0 g Bio－Beads SX－3(中性、多孔的聚苯乙烯－二乙烯基苯微球體;排斥極限:相對分子質量400～14 000)，柱床高32 cm;流動相:乙酸乙酯－環己烷(1∶1);流速:5.0 mL/min;樣品定量環:5.0 mL，濃縮至2 mL;預淋洗體積:85 mL;洗脫體積:50 mL;清洗體積:35 mL。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

己烯雌酚易溶于乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油或強堿溶液;甲基睪酮極性稍低于己烯雌酚，易溶于乙醇、丙酮、氯仿和醚類［1］。文獻報道常用甲醇作為兩者的提取劑［11］，而甲醇易溶于水且沸點較高，不易蒸干，考慮到后續GPC凈化要求無水，因此選擇不溶于水且易蒸干的乙醚作為提取液。實驗表明乙醚對兩者的提取效率均在90%以上。

2.2 GPC凈化條件的確定

甲基睪酮和己烯雌酚同屬蛋白同化激素，脂溶性強，基質效應嚴重，有效去除雜質是準確定量和實現低檢出限的關鍵。本實驗采用凝膠滲透色譜(GPC)凈化樣品。GPC基于分子大小分離原理，可有效去除色素、油脂等干擾物，常用于農藥的多殘留分析，但應用于激素類藥物殘留分析的報道并不多見。孫漢文等［17］利用凝膠滲透－固相萃取技術檢測了牛肉中甲基睪酮等9種類固醇激素;謝維平等［18］采用凝膠滲透色譜凈化/高效液相色譜法測定了魚肉中己烯雌酚等5種激素。GPC凈化的關鍵是選擇合適的切割時間以有效去除脂肪并保證藥物的回收率。本實驗采用GPC標準柱，參考給出的農藥標準凈化條件，根據甲基睪酮和己烯雌酚的結構和性質，改變了洗脫時間和主收集時間，用50 μg/kg的基質加標樣品進GPC凈化，根據色譜標準曲線計算回收率并考察除脂效果(見表1)。在表1中方案1即1 200～2 160 min的實驗條件下，雜質去除較為理想且兩種藥物的回收率均在85%以上。故選擇24～36 min作為收集時間。為更好地去除雜質干擾，進一步降低檢出限，GPC凈化后的樣品再過HLB固相萃取柱進一步凈化。

表1 3種GPC條件及回收率比較Table 1 Comparison of three GPC conditions and recoveries

2.3 檢測波長的選擇

同化激素在紫外區有較強吸收，根據這兩種激素對紫外光的吸收性質，分別于245、254 nm波長下對其進行同時檢測，發現254 nm時兩者分離效果好、響應值較高，譜圖基線較平穩，基質加標樣品在此波長下干擾較低，故選擇最佳檢測波長為254 nm。

圖1 0.5 mg/L混合標準溶液(A)及鰻鱺樣品加標50.0 μg/kg MET和DES(B)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 0.5 mg/L mixed standard solution(A)and blank eel sample spiked with 50.0 μg/kg MET and DES standard(B)

2.4 流動相的選擇

采用甲醇－水(73∶27)為流動相測定空白基質加標樣品，己烯雌酚在約4.8 min出峰，甲基睪酮在約6.8 min出峰，而雜質峰最后流出時間為4.2 min左右，和己烯雌酚的保留時間較為接近。當測定較低濃度的加標樣品時發現雜質峰對己烯雌酚峰有影響，干擾定量分析，也易出現樣品假陽性問題，因此逐步降低了有機相比例以延長兩種激素的保留時間，最終確定流動相為甲醇－水(72∶28)。此條件下，兩者的保留時間均推遲了約2.5 min，消除了雜質干擾。0.5 mg/L混合標準溶液的液相色譜圖和鰻鱺樣品加標50.0 μg/kg MET和DES的色譜圖見圖1。

2.5 線性范圍與檢出限

用甲基睪酮和己烯雌酚混合標準溶液配制質量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.5、2.0 mg/L的標準工作溶液，進樣后制作標準曲線，計算線性方程、相關系數及線性范圍。將空白樣品加標液逐級稀釋，取信噪比S/N=3的樣品濃度為方法檢出限(LOD)，取信噪比S/N=10的樣品濃度為方法定量下限(LOQ)。結果表明，兩種激素在各自線性范圍內，峰面積(Y)與其質量濃度(X)呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999(見表2)。方法檢出限和定量下限均可滿足實際檢測的需要。

2.6 方法回收率與精密度

選擇鰻鱺和對蝦作為空白樣品，添加10.0、50.0、200 μg/kg 3個水平的混合標準溶液做加標回收實驗，計算其回收率和精密度，采用50.0 μg/kg添加水平連續測定5 d，計算日間精密度，結果如表3所示。2種激素的平均回收率在84%～93%之間，日內精密度和日間精密度均小于6.0%。

表2 甲基睪酮與己烯雌酚的線性方程、線性范圍、相關系數(r)、檢出限及定量下限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r)，detection limits(LODs)and quantitation limits(LOQs)of MET and DES

表3 樣品中甲基睪酮和己烯雌酚的加標回收率及相對標準偏差(n=5)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of MET and DES(n=5)

2.7 實際樣品分析

應用建立的方法對舟山市場上購得的羅非魚、對蝦和鰻鱺各10個樣品進行肌肉中甲基睪酮和己烯雌酚殘留量的測定。結果在這些樣品中均未檢出這兩種激素，表明該批樣品無甲基睪酮和己烯雌酚的安全隱患。

3 結論

本實驗建立了水產品中甲基睪酮和己烯雌酚殘留的凝膠滲透色譜－固相萃取凈化/高效液相色譜檢測方法，通過GPC的良好凈化能力，有效降低了基質干擾，簡化了實驗步驟，提高了方法的檢測靈敏度，分離效果良好，可滿足日常監測工作的需要。

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