福建黃兔卵泡抑制素βA亞基cDNA的克隆與序列分析

桑 雷，孫世坤，陳冬金，陳巖峰，謝喜平

(福建省農業科學院 畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013)

抑制素( Inhibin, INH) 是睪丸支持細胞和卵巢顆粒細胞分泌的一類糖蛋白激素, 由α和β兩個亞基通過二硫鍵連接而成的二聚體[1]，其α亞基上有糖基化位點，β亞基有A、B 兩種類型, 故INH存在2種形式，即INHA(αβA)和INHB(αβB)[2]。二硫鍵是INH行使抑制垂體FSH分泌功能所必須的主鍵，分離的α和β亞基均無生物學活性[3]。INH對動物生殖機能具有重要調節作用，INH對雌性動物最基本的生物學作用是抑制FSH的合成和分泌, 調節卵泡發育和成熟。INH對雌性動物卵泡發育的作用隨著卵泡的逐漸成熟而增強, 這種作用具有劑量依賴關系[4]。通過抑制素抗原免疫可以促進動物卵泡發育，有效地提高雌性動物的排卵率，提高家畜的繁殖力。在雄性動物中，INH主要與公畜的精液品質和雄性不育顯著相關，抑制素免疫能有效提高雄性動物的繁殖性能[5]。在生產上，INH是確定單胎和多胎動物種屬特異性排卵數最重要的激素之一[6-7]。因此，INH的α和β亞基可作為研究家畜繁殖性狀的候選基因。

福建黃兔是我國地方優良肉兔品種，具有適應性廣、抗病力強、胴體品質好、繁殖率高等諸多優點[8]。本試驗以福建黃兔為對象，克隆了卵泡抑制素βA亞基基因(INHBA)，并對其進行生物信息學分析，為下一步研究福建黃兔的高繁特性提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

總RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒純化試劑盒購自Omega公司；pMD18-T載體、AMV反轉錄酶、DNA Maker和dNTPs(2.5mmoloL-1)均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR Master Mix(2×)購自fermentas；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA制備 從福建省連江玉華山生態農場購買福建黃兔母兔，在發情中期屠宰黃兔，取出垂體，在液氮中充分研磨后，按照Total RNA I(OMEGA)說明書提取垂體組織總RNA。按照AMV反轉錄酶使用說明書進行反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 PCR引物的設計 根據GeneBank中家兔INHBAcDNA的預測序列(XM_002713770.1)設計引物，預計擴增的產物片段大小約為1 200 bp左右，上游引物5'-ATGCCCTTGCTCTGG-3'，下游引物5'-CTATGAGCAGCCACAC-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 RT-PCR擴增 用所設計的引物進行PCR擴增，擴增體系為20 μL，其中2×Mix 10 μL、上下游引物(100 μmolomL-1)各0.2 μL、cDNA 0.2 μL、補充去離子水至20 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min后進入循環，循環參數94 ℃變性 30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環后，72 ℃延伸10 min。反應結束后，用1.0%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳并觀察。

1.2.4 PCR產物的克隆與鑒定 PCR產物經膠回收試劑盒回收純化后與pMD18-T載體在16 ℃下連接過夜。連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，涂布含50 μg/mL氨芐青霉素LB平板，過夜培養，篩選陽性克隆。隨機挑取5個陽性克隆，用PCR法和雙酶切法鑒定重組質粒。

1.2.5 序列測定及分析 將鑒定為陽性的克隆由寶生物工程(大連)有限公司進行DNA測序。利用DNAStar等軟件，將所得到的cDNA序列與Genbank數據庫中已知的哺乳動物INHBA基因相應序列進行序列分析。

2 結 果

2.1 總RNA的分離

所分離總RNA A260/A280為1.9，瓊脂糖凝膠電泳后清晰可見18S和28S 2條核糖體RNA條帶(見圖1)，圖1說明腦垂體組織總RNA提取過程中未發生降解。

2.2 RT-PCR擴增、PCR產物克隆及其鑒定

RT-PCR擴增后，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到明顯特異性條帶，PCR產物大小與預期結果一致，大約為1 200 bp(見圖2)。PCR產物純化后與pMD18-T載體連接，連接產物轉化至DH5α細胞中，經氨芐青霉素平板篩選，隨機挑取5個陽性克隆，通過PCR和雙酶切進行鑒定，證實擴增克隆的片段大小均正確。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose electrophoresis of total RNA

圖2 福建黃兔INHBA PCR擴增產物Fig. 2 PCR product of INHBA of Fujian Yellow Rabbit

M. D2 000 DNA Maker; I.INHBA基因擴增條帶

M. D2 000 DNA Maker; I. amplification product ofINHBAgene

2.3 序列分析

2.3.1 黃兔INHBA基因信息 黃兔INHBAcDNA經測序得到由1 275 bp組成的開放閱讀框(ORF)，其實密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。將所得序列登陸到GenBank(登錄號：KC831577)。采用DNASTAR軟件分析INHBA基因cDNA序列中的A、T、G、C的含量，比例分別為23.76%、31.92%、16.24%、28.08%，G+C含量(60%)高于A+T的含量(40%)；該段序列共編碼424個氨基酸，通過SignalP 4.1 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)預測發現黃兔INHBA蛋白在第20和21氨基酸之間存在信號肽的切割位點(D=0.793，D-cutoff=0.450)，整個蛋白包括20個氨基酸的信號肽和404個氨基酸的成熟肽(見圖3)。利用NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線工具Conserved Domain Search Service軟件分析發現INHBA蛋白在第30至250氨基酸處存在1個TGF-β前肽結構域及在第318至423氨基酸處存在1個TGF-β結構域(見圖4)。

2.3.2 同源性序列分析 應用Lasergene v7.1 DNAStar軟件對所測得結果進行分析，結果顯示，所擴增的黃兔INHBA基因長度約為1 275 bp與靈長目中的人、大猩猩同源性分別為91.0%和91.3%，與偶蹄目中的奶牛、山羊、綿羊、豬同源性分別為89.2%、89.6%、89.7%和88.3%，與奇蹄目中的馬的同源性為88.8%，與嚙齒目中的家鼠、挪威鼠、黃金地鼠同源性分別為88.1%、87.8%、87%，與家貓的同源性為89.5%見表1。根據INHBA基因的同源性構建的系統進化樹發現，黃兔與靈長目動物同源性很高見圖5。

圖3 INHBA蛋白的信號肽預測Fig. 3 Signal P prediction of INHNA protein

圖4 INHBA蛋白的結構域Fig. 4 Structural domain of INHBA protein

表1INHBA基因在哺乳動物之間核酸同源性比較
Table 1 Homology analysis ofINHBAon nucleotides in kinds of mammalians

3 討 論

通過對INHBA基因的cDNA序列進行生物信息學分析發現，該序列含有完整的開放式閱讀框，含有1275個核苷酸，編碼424個氨基酸的INHBA前體蛋白，其中前20個氨基酸經預測為信號肽，21至424為成熟的INHBA蛋白。通過對福建黃兔和不同哺乳動物的INHBA基因序列進行比對發現，黃兔的INHBA基因與靈長目中的人、大猩猩親緣性最高，達到90%以上，與偶蹄目中的奶牛、山羊、綿羊、豬同源性介于85%～90%之間，與奇蹄目中的馬的同源性為88.8%，與嚙齒目中的家鼠、挪威鼠、黃金地鼠同源性在85%以上，在不同的哺乳動物物種間高度保守。對INHBA蛋白進行結構域分析，該蛋白含有1個TGFβ家族結構域和1個TGFβ前體超家族結構域，具有自分泌和旁分泌生長因子的活性，可以通過與TGFβ家族受體或TGFβ超家族受體結合，參與垂體、性腺和胎盤等多種細胞器的生長和發育[9-11]，此間接佐證了抑制素通過兩個結合蛋白：β多聚糖(TGFβ家族III受體)和抑制素結合蛋白(INHBP120)發揮生物學作用的共受體假說[3]。動物的生殖主要受下丘腦-垂體-性腺軸分泌的生殖激素調控，其中促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)作用于性腺，通過調節雄性動物的精子發生、成熟過程和雌性動物的排卵過程參與生殖調控[12]。INH對FSH起負反饋調節作用，調控FSH的合成與分泌，進而影響到生殖細胞的發育和成熟[13]。INHBA基因多態性主要與公畜繁殖性狀(主要為精液品質)相關[14-17]；在母畜上，小尾寒羊INHBA基因第2外顯子上檢測到的1個SNP(A218G)與產羔數顯著相關(P<0.05)[18]。

圖5 INHBA基因核酸序列的遺傳進化Fig. 5 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of INHBA gene

4 結 論

因此，INHBA基因可以作為篩選影響福建黃兔繁殖性狀的候選基因，對INHBA克隆和序列分析，可以為后續的多態位點檢測提供參考。

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