醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體的精確鑒定與藥敏分析

聶璐，白銀磊，李聰然，游雪甫

不動桿菌屬（Acinetobacter spp.）是一類非發酵糖革蘭陰性球桿菌，是近年來引起院內感染高發病率和死亡率的重要原因[1]。其中鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）臨床分離率最高，可引起包括呼吸機相關性肺炎、皮膚和軟組織感染、傷口感染、繼發性腦膜炎、血行感染等各種感染[1-2]。氨基糖苷類及碳青霉烯類抗生素因其廣譜、高效的特點，常用于臨床治療鮑曼不動桿菌感染[3-4]。但近年來，隨著臨床上廣譜抗生素的大量使用，鮑曼不動桿菌呈現日益嚴峻的廣泛耐藥及多重耐藥狀況，受到各界關注[5-8]?；诖?，藥敏實驗結果的準確性就顯得尤為重要。

目前對于不動桿菌菌種的鑒定及藥敏檢測，臨床多運用 VITEK 2等高效、便捷的自動化分析儀器進行，進而輔助臨床給出適當的給藥治療方案。對于菌種的鑒定，這類自動化分析儀器主要依靠菌株表型的差異進行，但常引起院內感染的鮑曼不動桿菌在表型上與醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoacelicus）、菌種3（Acinetobacter genomic species 3）和13TU（Acinetobacter genomic species 13TU）十分相似，通過表型鑒定難以區分，因而將它們合稱為醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體（Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex）[9]。雖然各成員表型相近，但流行病學特征卻有很大不同[10-11]。

菌種的精確鑒定及藥敏的準確測定，以對鮑曼不動桿菌臨床分布及耐藥情況準確認識為前提?；诖?，本研究在運用 VITEK 2 對不動桿菌臨床分離株進行初步菌種鑒定的基礎上，對難以區分的醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體菌株進一步進行 16S rRNA 序列分析，明確受試菌株的菌種類型。對確證的醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體菌株，運用VITEK 2 及微稀釋法進行藥敏實驗，對藥敏實驗結果進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 受試菌株為實驗室保藏的2006–2009年北京地區三甲醫院收集的232 株不動桿菌。質控菌為大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922、鮑曼不動桿菌 ATCC 19606。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶購自美國Promega公司；引物由美國 Invitrogen 生物工程公司合成；VITEK 2 革蘭陰性細菌鑒定卡、藥敏試驗卡 AST-GN13 購自法國梅里埃公司；MH 瓊脂、營養肉湯培養基購自美國 Difco公司；阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、厄他培南、亞胺培南購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.3 主要儀器 VITEK 2 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統購自法國梅里埃公司；基因擴增儀、電泳儀、凝膠成像儀購自美國 Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

1.2.1.1 VITEK 2 試卡法 按儀器操作說明使用VITEK 2 革蘭陰性細菌鑒定卡對收集的所有不動桿菌進行菌種鑒定。

1.2.1.2 16S rRNA 序列分析 對所有經 VITEK 2鑒定為醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體的菌株，運用聚合酶鏈式反應進行 16S rRNA 序列擴增測序[12]，并將測序結果在美國國家生物技術信息中心數據庫（national center for biotechnology information，NCBI）中進行 BLAST 比對分析，確定醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體菌株所屬準確種屬。16S rRNA擴增引物為27F：5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'，519R：5' GTATTACCGCGGCTCCTG 3'，擴增條件為93 ℃ 預變性 3 min，然后以 93 ℃ 60 s、52 ℃ 35 s、72 ℃ 50 s 循環 35周期，最后1周期為72 ℃ 延伸 5 min。

1.2.2 藥敏實驗

1.2.2.1 VITEK 2 試卡法 按儀器操作說明，使用 VITEK 2 藥敏試驗卡 AST-GN13 對所有精確鑒定的醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體菌株進行藥敏實驗。

1.2.2.2 微稀釋法 依據 CLSI 推薦藥敏試驗方法，采用 CAMH（cation-adjusted Mueller-Hinton broth）肉湯微稀釋法進行藥敏定量試驗，測定抗生素阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、厄他培南、亞胺培南對所有精確鑒定的醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體的MIC 值?？股販y定濃度范圍為0.03～1024μg/ml，細菌接種量為5×105cfu/ml。

1.2.2.3 藥敏結果分析 依據 CLSI 推薦標準判斷微稀釋法藥敏檢測結果。VITEK 2 藥敏結果與微稀釋法結果進行比較，依據如下標準分類，并計算各類的百分率。標準符合率（categorical agreement，CA）：VITEK 2 藥敏結果與微稀釋法結果完全一致；嚴重錯誤（very major error，VME）：微稀釋法結果為耐藥（resistance，R），而 VITEK 2 藥敏結果為敏感（susceptible，S）；重大錯誤（major error，ME）：微稀釋法結果為S，而 VITEK 2 藥敏結果為R；微小錯誤（minor error，MIE）：微稀釋法結果為R 或 S，而 VITEK 2 藥敏結果為中介（intermediate，I）或微稀釋法結果為I，而 VITEK 2 藥敏結果為R 或 S。

2 結果

2.1 菌株鑒定結果

232 株受試菌經 VITEK 2 鑒定，195 株（84.05%）為醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體菌株。醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體菌株經 16S rRNA 序列擴增，獲得特異性條帶（圖 1）。擴增產物經測序，并將測序結果在NCBI 數據庫中進行 BLAST 比對分析（圖 2），分析確證其中 173 株（88.72%）為鮑曼不動桿菌，22 株（11.28%）為醋酸鈣不動桿菌，其他成員未檢出。

圖1 16S rRNA PCR 擴增片段Figure1 The 16S rRNA fragment by PCR

圖2 16S rRNA 序列 BLAST 比對Figure2 16S rRNA sequence alignment

2.2 藥敏實驗結果

173 株鮑曼不動桿菌的藥敏檢測結果及誤差分析見表1。從微稀釋法測定結果看，受試鮑曼不動桿菌對三種氨基糖苷類抗生素（阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素）均呈現高水平耐藥，MIC50值皆大于512μg/ml，其中阿米卡星活性稍強，而慶大霉素耐藥程度最高；受試鮑曼不動桿菌對兩種碳青霉烯類抗生素（亞胺培南和厄他培南）敏感度較高，亞胺培南和厄他培南的MIC50分別為1和4μg/ml。藥敏誤差分析顯示，與微稀釋法結果相比，各抗生素用 VITEK 2 試卡法進行的藥敏檢測結果存在不同程度的誤差，厄他培南藥敏結果符合率最低（僅為64.16%），出現重大錯誤的菌株占23.12%；阿米卡星藥敏結果符合率稍高（65.90%），但出現嚴重錯誤的菌株高達 34.10%；而其余三種抗生素慶大霉素、妥布霉素和亞胺培南的VITEK 2藥敏檢測結果符合率較高（分別為87.28%、84.39%和95.38%），但妥布霉素的嚴重錯誤率也高達13.87%。

表1 173 株鮑曼不動桿菌對五種抗生素的MIC 值分析Table1 MICs and error rates obtained for 173 isolates of the Acinetobacter baumannii tested for susceptibility to three aminoglycosides and two carbapenems by VITEK 2

表2 22 株醋酸鈣不動桿菌對五種抗生素的MIC 值分析Table2 MICs and error rates obtained for 22 isolates of the Acinetobacter calcoaceticus tested for susceptibility to three aminoglycosides and two carbapenems by VITEK 2

22株醋酸鈣不動桿菌的藥敏檢測結果及誤差分析見表2。從微稀釋法測定藥敏結果看，受試醋酸鈣不動桿菌對三種氨基糖苷類抗生素（阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素）及兩種碳青霉烯類抗生素（厄他培南和亞胺培南）均呈現較高敏感度，MIC50值分別為4、1、1、2和0.125μg/ml。其中碳青霉烯類抗生素活性稍強于氨基糖苷類抗生素。藥敏誤差分析顯示，與微稀釋法結果相比，VITEK 2試卡法進行的藥敏檢測結果中，厄他培南藥敏結果符合率最低（僅為59.09%），出現重大錯誤的菌株高達 40.91%；妥布霉素的藥敏結果符合率稍高（77.27%），出現嚴重錯誤的菌株占 18.18%；亞胺培南的藥敏結果全部相符；其余兩種抗生素阿米卡星和慶大霉素的藥敏檢測結果符合率較高，分別為90.91%和86.36%。

3 討論

目前臨床分離菌株的菌種鑒定主要依靠表型差異進行，VITEK 2等全自動分析儀憑借高效、便捷的優點成為臨床常用的技術方法，但其只能鑒定不動桿菌屬中有限的幾個種，對生化特性相近的鮑曼不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌、菌種3和13TU 則難以區分。鮑曼不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌、菌種3和13TU 雖然表型相似，但流行病學特征卻大相徑庭，醋酸鈣不動桿菌主要存在于環境樣本，菌種3 主要存在于皮膚表面和環境樣本，菌種13TU 主要存在于臨床樣本，而鮑曼不動桿菌則為院內感染的主要病原體之一[10-11]。菌種鑒定不精確的缺陷，導致目前很多有關鮑曼不動桿菌的耐藥及流行病學資料存在誤差，嚴重影響了對鮑曼不動桿菌耐藥現狀及臨床分布狀況的認知。

本研究結合 16S rRNA 序列分析進一步確證，經 VITEK 2 鑒定為醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體的195 株菌株中，88.72% 為鮑曼不動桿菌，11.28% 為醋酸鈣不動桿菌。

耐藥率高低與臨床治療用藥策略的選擇直接相關。多年來由于慶大霉素敏感率低，臨床已逐漸棄用，而代之以阿米卡星的廣泛使用，尤其針對產ESBLs的革蘭陰性桿菌，臨床仍主張首選碳青霉烯類與阿米卡星聯合使用。伴隨著治療策略的改變，臨床分離菌株對阿米卡星耐藥率也逐年升高，且一旦耐藥即呈現為高水平耐藥的趨勢。我們研究發現，2006–2009年收集的173 株北京地區臨床分離鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥情況嚴重，阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素的敏感率分別僅為41.04%、30.64%和38.15%，三者的MIC50值皆大于512μg/ml；22 株醋酸鈣不動桿菌對這兩類抗生素整體都表現出較高的敏感度，尤其是對碳青霉烯類呈現出100% 敏感，對厄他培南及亞胺培南的MIC50值分別為2μg/ml和0.125μg/ml。

微稀釋法可確定被檢菌對某抗菌藥物的MIC，是 CLSI 推薦的藥敏定量試驗，可作為其他藥敏定量試驗方法的評價標準。因微稀釋法操作繁瑣、工作量大，在臨床大標本量的藥敏實驗中未被推廣使用。VITEK 2等全自動分析儀卻很好地彌補了這類缺陷，廣泛應用于臨床藥敏檢測中。氨基糖苷類和碳青霉烯類抗生素是臨床上治療鮑曼不動桿菌感染的常用藥物，臨床往往根據 VITEK 2等全自動分析儀所得的藥敏檢測結果制定相應治療方案，因此其藥敏檢測結果的準確性對臨床治療至關重要。

在本研究中，通過與微稀釋法藥敏檢測結果相比，顯示 VITEK 2 在藥敏檢測中存在局限性，某些藥物的藥敏檢測結果準確度低，可能造成臨床治療方案的不合理。研究結果顯示，與微稀釋法藥敏檢測結果相比，鮑曼不動桿菌經 VITEK 2 測得的五種抗生素的藥敏檢測結果均存在不同程度的誤差。其中阿米卡星尤為嚴重，藥敏結果符合率僅為65.90%，嚴重錯誤率高達 34.10%。這使臨床對很多阿米卡星耐藥的鮑曼不動桿菌做出敏感判斷，導致不合理用藥方案的制定，從而延誤治療，并可能因不合理用藥導致菌株耐藥情況的加重。妥布霉素藥敏結果符合率達 84.39%，但其嚴重錯誤占13.87%。慶大霉素藥敏符合率較高，為87.28%，但也存在嚴重錯誤和微小錯誤。本研究中氨基糖苷類抗生素藥敏檢測誤差分析結果與Akers等[13]研究結果相符。厄他培南藥敏結果不符合率稍高于阿米卡星，重大錯誤率為23.12%，這使臨床對部分厄他培南敏感的鮑曼不動桿菌菌株做出耐藥判斷，很可能使治療方法中可選藥物減少，使臨床患者得不到及時有效治療。亞胺培南藥敏結果符合率最高，達 95.38%，但也存在嚴重錯誤和微小錯誤。本研究中碳青霉烯類抗生素藥敏檢測誤差分析結果與Markelz等[14]研究結果相符。受試菌中的鮑曼不動桿菌對這兩種碳青霉烯類抗生素均呈現較高敏感度，且亞胺培南活性更強。

醋酸鈣不動桿菌經 VITEK 2 測定所得的五種抗生素的藥敏檢測結果，除厄他培南藥敏結果符合率較低外，其余藥敏結果符合率都在80% 左右，亞胺培南的藥敏結果符合率更是達到了 100%。厄他培南藥敏結果符合率最低，僅為59.09%，出現重大錯誤率為40.91%；妥布霉素的藥敏結果出現較多嚴重大錯誤，嚴重錯誤率為18.18%。這都可能造成臨床上不合理治療方案的出現。

16S rRNA 序列分析是一種簡單、可靠、重復性高的菌種鑒定方法，鑒于VITEK 2 在不動桿菌菌種鑒定中的局限性，可輔以 16S rRNA 序列分析，精確鑒定醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體；鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗生素呈現高水平耐藥，醋酸鈣不動桿菌對碳青霉烯類抗生素呈現高水平敏感；VITEK 2 測定鮑曼不動桿菌對阿米卡星藥敏結果符合率低，嚴重錯誤率高，測定醋酸鈣不動桿菌對厄他培南藥敏結果的符合率低，重大錯誤率高，建議輔以微稀釋法。

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