新型核苷衍生物十八烷氧乙基替諾福韋酯的體內外抗乙型肝炎病毒作用研究

李思陽，李壯，陳淑珍，章天，王淑琴，李毅，陶佩珍，李卓榮

核苷（酸）類似物（NAs）是乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶抑制劑，它通過與內源性底物的競爭性結合或是嵌入病毒 DNA 作為鏈終止來發揮其抗病毒作用，是目前抗 HBV的主要藥物品種之一。NAs 可以有效地降低細胞中 HBV的DNA 含量到檢測水平以下，并且可以大幅改善臨床及病理組織學表現[1]。但是，該類藥物普遍存在腎臟毒性較大、易產生耐藥和有交叉耐藥等問題。替諾福韋（TFV）是無環腺嘌呤單核苷酸衍生物，是病毒逆轉錄酶或 DNA 聚合酶抑制劑，但由于其結構中磷酸基帶負電荷，極性太強，生物膜透過性差，導致生物利用度很低，使其不能成為藥物應用于臨床[2]。替諾福韋雙異丙酰氧基甲酯富馬酸鹽（TFV-DF，圖 1）為其雙酯性前藥，生物利用度有了一定的提高，但也只有 25%～40%（取決于飲食中脂肪含量）[3]。

替諾福韋的磷酸十八烷氧乙基單酯衍生物（octadecyloxyethyl-tenofovir，ODE-TFV，圖 1），是抗 HBV 候選化學藥物的一種新型結構。ODE-TFV 與TFV-DF 同為前藥化合物，吸收進入體內后游離出活性成分 TFV 發揮抗病毒作用。因此，在應對臨床病毒耐藥性問題上，該藥將具有與TFV-DF 及TFV 相似的特點，即藥物本身不易發生耐藥、與拉米夫定等環狀核苷無交叉耐藥。與臨床藥物 TFV-DF 相比，研究結果顯示，ODE-TFV具有更強的化學穩定性和更高的口服生物利用度。本研究即是評價 ODE-TFV 在乙型肝炎病毒基因轉染的人肝癌細胞系 2.2.15 細胞和鴨肝炎病毒（DHBV）感染雛鴨模型中抗 HBV的活性，并評價其對肝臟病理的改善效果，為進一步的研究開發提供藥效學數據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 藥物 ODE-TFV 由本研究組分批合成，純度為93.8%～97.2%。TFV-DF 由本研究組制備合成，純度 98.7%，以 0.3% 羧甲基纖維素鈉制備成懸液備用。陽性藥物拉米夫定（3TC）為英國 Glaxo Wellcome公司生產，批號：2005110011，用生理鹽水配制實驗用溶液。

圖1 ODE-TFV 及TFV-DF結構式Figure1 Chemical structure of ODE-TFV and TFV-DF

1.1.2 細胞 乙型肝炎病毒 DNA 克隆轉染人肝癌細胞（Hep G2）的2.2.15 細胞系由美國 Mount Sinai 醫學中心構建，本所病毒室引進后自行傳代培養。

1.1.3 試劑及儀器 放射性同位素 α32P dCTP 為美國 PE公司產品，比活度為9.25 MBq；探針標記用的隨機引物試劑盒購自美國 Promega公司；Sephadex G-50，Ficoll PVP 購自瑞典 Pharmacia公司；SDS 為德國 Merck公司產品；牛血清白蛋白購自中國科學院生物物理所；0.45 μmol/L的硝酸纖維素膜是瑞典 Amersham公司的產品。

1.1.4 病毒 鴨乙型肝炎病毒 DNA（DHBVDNA）陽性鴨血清采自上海麻鴨，–70 ℃ 保存。

1.1.5 實驗動物 1 日齡北京鴨，購自北京前進種鴨飼養場。

1.2 方法

1.2.1 在2.2.15 細胞培養中對 HBV-DNA的抑制試驗

1.2.1.1 細胞毒性試驗 ODE-TFV 配成10 mmol/L的母液，用 2.2.15 細胞培養液配成所需濃度，然后用培養液從 200 μmol/L 開始 3 倍稀釋，共 4個濃度，加入 96 孔細胞培養板，每濃度 3 孔，每 4 天換同濃度藥液，設空白對照組，培養 8 d。顯微鏡下觀察細胞病變，完全破壞為4；75% 破壞為3；50% 破壞為2；25% 破壞為1；無病變為0。計算每濃度藥液平均細胞病變程度和抑制率。按 Reed & Muench 法計算半數毒性濃度（TC50）。

1.2.1.2 HBV-DNA的抑制試驗 各濃度組藥液及細胞對照組的2.2.15 細胞上清液按分子克隆實驗技術方法提取 HBV-DNA，各樣品分別進行斑點雜交、放射自顯影，用酶標檢測儀測定 IOD 值，計算血清 HBV-DNA 密度，以雜交斑點 IOD 值作為標本 HBV-DNA 水平值，計算 HBV-DNA 抑制率、半數有效濃度（IC50）和選擇指數（SI）。本實驗重復 3 次，取平均值。

HBV-DNA 抑制率（%）=（IOD細胞對照－IOD給藥組）/ IOD細胞對照×100%。

1.2.2 在鴨肝炎病毒感染雛鴨模型中對 DHBVDNA的抑制試驗

1.2.2.1 鴨乙型肝炎病毒感染 1 日齡北京鴨，經腿脛靜脈注射上海麻鴨 DHBV-DNA 陽性鴨血清，每只 0.2ml。感染后第 7 天取血，分離血清，置于–70 ℃ 保存待檢（T0）。

1.2.2.2 藥物治療試驗 將 48只感染鴨按隨機區組分組法[4]分為8組：病毒對照組；ODE-TFV高、中、低劑量組（200、100和50 mg/kg）；陽性藥 TFV-DF 高、低劑量對照組（200和100 mg/kg）；陽性藥 3TC 高、低劑量對照組（80和40 mg/kg）。所有藥物均灌胃給藥，每日 2 次，共給藥 14 d，分別在感染后第 7 天即給藥前（T0），給藥后第7 天（T7），第 14 天（T14）及停藥后的第 3 天（P3），自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，置–70 ℃ 保存待檢。

1.2.2.3 檢測方法 取上述待檢鴨血清，每批同時點膜，測定鴨血清中 DHBV-DNA 水平的動態變化。按試劑盒說明書方法，用32P 標記 DHBV-DNA探針，并作鴨血清斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，以雜交斑點 IOD 值作為標本 HBV-DNA 水平值。

1.2.2.4 數據處理 計算每組鴨不同時間血清DNA IOD 值的平均值，以表示，并將每組鴨用藥后不同時間（T7、T14）和停藥后第 3 天（P3）的血清 DHBV-DNA 水平與同組給藥前（T0）IOD值比較，采用配對 t 檢驗，計算 t1、P1值。分析差異的顯著性，判斷藥物對病毒感染的抑制效果。計算每組鴨用藥后不同時間（T7、T14）和停藥第 3 天（P3）的血清 DHBV-DNA的抑制率。

血清 DHBV-DNA 抑制率（%）=（IOD給藥前－IOD給藥后）/IOD給藥前×100%。

將給藥治療組不同時間的DHBV-DNA 抑制率分別與病毒對照組相同時間的DHBV-DNA 抑制率作比較，采用成組t 檢驗，作統計學處理，計算 t2、P2值，分析差異的顯著性，判斷藥效。

1.2.3 對肝組織病理學改善作用的試驗 鴨乙型肝炎病毒的感染和給藥方法同 1.2.2.2，陽性對照藥3TC的劑量改用 35、70 mg/kg，給藥 14 d，停藥，即刻殺死小鴨，取肝臟。經固定、脫水、包埋后進行切片，染色后在光學顯微鏡下觀察各組肝臟病理變化并進行比較。在細胞浸潤觀察中，±表示基本未見或有微量炎細胞浸潤；+ 表示少量炎細胞浸潤；++ 表示中等量炎細胞浸潤或少量炎細胞浸潤加片狀炎細胞浸潤；+++ 表示大量炎細胞浸潤或中等量炎細胞浸潤加片狀炎細胞浸潤。在肝細胞彌漫性氣球樣變性的觀察中，–表示基本未見肝細胞彌漫性氣球樣變性；+ 表示肝細胞彌漫性氣球樣變性。在肝細胞灶性壞死的觀察中，–表示基本未見肝細胞呈灶性壞死；+ 表示肝細胞呈灶性壞死。

2 結果

2.1 在2.2.15 細胞培養中對 HBV-DNA的抑制作用

樣品對 2.2.15 細胞 TC50及在2.2.15 細胞培養中對 HBV-DNA的抑制作用的結果見表1。由表1 可知，ODE-TFV 對 HBV-DNA 復制顯示出強抑制活性，較陽性對照藥 TFV-DF和3TC 分別提高約 18 倍和13 倍，ODE-TFV的選擇指數也明顯高于TFV-DF。

2.2 在鴨肝炎病毒感染雛鴨模型中對 DHBV-DNA的抑制作用

實驗藥物對鴨血清 DHBV-DNA的抑制作用見表2。本批實驗感染鴨共 48只，血清 DHBVDNA 全部呈陽性。病毒對照組6只雛鴨在實驗全程 24 d 內血清 DHBV-DNA 水平感染后基本平穩。全程不同時間血清 DHBV-DNA 有自然波動。ODE-TFV 100 mg/kg組鴨血清 DHBV-DNA 抑制率與病毒對照組相比，在T7、P3有顯著性差別（P＜0.05）。ODE-TFV 200 mg/kg組在T7、P3血清DHBV-DNA 抑制率與病毒對照組比較，有顯著性和非常顯著性差別（P＜0.05、P＜0.01）。陽性對照藥 TFV-DF 200 mg/kg組在P3血清 DHBV-DNA抑制水平與病毒對照組相比，有顯著性意義（P＜0.05），其他時間段成組對比，雖有抑制作用，但無顯著性差異。對照藥 3TC 40 mg/kg組在T7、T14，鴨血清 DHBV-DNA 抑制率與病毒對照組相比，有顯著性意義（P＜0.05）。3TC 80 mg/kg組在T7、T14，鴨血清 DHBV-DNA 抑制率與對照組相比，均有顯著性差別（P＜0.05）。

表1 ODE-TFV、TFV-DF和3TC 在2.2.15 細胞中的細胞毒性與對 HBV-DNA的抑制作用Table1 Cytotoxicity and inhibitory effects of ODE-TFV,TFV-DF and 3TC on HBV-DNA in cell line 2.2.15

如若把給藥劑量單位由 mg/kg 折算成 mol/kg，3 種試驗藥物的給藥劑量分別為：ODE-TFV 為0.086、0.17和0.34 mol/kg；TFV-DF 為0.17和0.32 mol/kg；3TC 為0.18和0.35 mol/kg。在幾乎等摩爾劑量下（0.17和約 0.34 mol/kg），ODE-TFV在T7、3TC 在T7和T14對 DHBV-DNA 復制顯示出明顯的抑制作用，而在停藥后第 3 天，ODE-TFV 治療組仍然顯示出一定的持續抑制病毒作用，3TC 治療組停藥后鴨血清病毒 DNA 水平明顯反跳。

表2 ODE-TFV 對鴨血清 DHBV-DNA的抑制作用Table2 Inhibition effect of ODE-TFV on duck serum DHBV-DNA

圖2 ODE-TFV 對 DHBV 感染的鴨肝臟病理學的影響（20×）Figure2 Hepatic pathologic effects of ODE-TFV on DHBV infected duck liver (20×)

表3 鴨肝臟光學顯微鏡檢查結果Table3 The result of ducks liver inspected by optical microscope

2.3 對 DHBV 感染雛鴨的肝臟病理改善效果

DHBV 感染雛鴨模型體內抑制病毒作用實驗結束時，留取實驗肝臟組織進行病理學觀察（圖 2和表 3）。病毒對照組鴨肝病理切片經 HE 染色后，可觀察到的主要病變為肝臟細胞氣球樣變性、肝細胞壞死和炎細胞浸潤。ODE-TFV 治療組的鴨肝臟病理切片顯示，炎癥細胞的浸潤和肝細胞壞死得到顯著改善，肝竇內炎細胞浸潤的改善存在一定的劑量關系，劑量越大，改善越明顯（圖 2B、2C、2D）；TFV-DF組，炎細胞浸潤和對照組相比有所改善，但不如相同劑量的ODE-TFV組改善明顯（圖 2E、2F）；3TC組病理結果表明，3TC 可以一定程度改善肝細胞壞死和炎細胞浸潤，不過，其改善效果也不如 ODE-TFV各組明顯（圖 2G、2H）。但是，所有給藥組對鴨肝細胞氣球樣變性均沒有明顯改善。

3 討論

本研究對 ODE-TFV 體外活性的評價是以人肝癌細胞系 2.2.15 細胞作為模型，以陽性藥物TFV-DF和3TC 作為對照，檢測目標化合物ODE-TFV的抗病毒效果。實驗結果顯示，在2.2.15細胞培養內 ODE-TFV 對 HBV-DNA的抑制活性較 TFV-DF和3TC 分別強約 18 倍和13 倍，體現出了較強的抑制病毒復制的作用。但是，2.2.15細胞模型也存在一定的缺陷：不同于自然感染，在該細胞株中，HBV 基因組整合在宿主細胞的染色體上；復制方式與自然感染不同，并且很難被清除；病毒的復制水平不能人為改變，并且復制水平低；2.2.15 細胞雖再現了 HBV 在肝細胞的復制和表達，但脫離了機體免疫系統對 HBV 產生影響的環境。因此，應用該模型進行的實驗研究只能反映出藥物對 HBV的直接抑制作用，但不能反映藥物通過免疫功能來發揮間接抗 HBV的作用[5]。

本研究利用 DHBV 感染雛鴨模型評價ODE-TFV 體內抗病毒活性及改善肝臟病理的作用。研究結果顯示，ODE-TFV 低劑量組未表現出明顯的抗病毒活性，ODE-TFV的中、高劑量組對DHBV-DNA的復制有明顯的抑制作用。同時，我們也觀察了 ODE-TFV 在鴨體內對 DHBV 感染的肝臟病理學的改善，結果表明，ODE-TFV能夠有效改善 DHBV 引起的肝細胞壞死和炎細胞浸潤，有一定量效關系。綜合以上研究結果，我們不難發現，ODE-TFV 作為新的非環核苷類抗病毒化合物，在體內外對 HBV 均具有明顯的抑制活性和改善肝臟病理的作用，與對照藥 TFV-DF 及3TC相比較，也有較好的抗病毒效果，值得進一步深入研究。

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